במחקר שפורסם לאחרונה ב מחלות זיהומיות מתעוררותקבוצת חוקרים השוותה את התפלגות קולטני החומצה הסיאלית (SA) בדרכי הנשימה ובבלוטות החלב של בקר חלב הנגוע באופן טבעי בנגיף שפעת העופות הפתוגנית ביותר (HPAI) A(H5N1) מדבק וקטלני של וירוס שפעת העופות זן H5N1).
רקע כללי
במרץ 2024, משרד החקלאות של ארצות הברית (ארה"ב) דיווח על זיהוי ראשון של וירוס HPAI H5N1 בבקר לחלב בארה"ב. נוכחותם של קולטני וירוס ספציפיים על תאי מארח משפיעה על הרגישות לזיהום HPAI H5N1. עם זאת, התפלגות קולטני SA בבקר לחלב, במיוחד בבלוטות החלב, עדיין לא מובנת. דרוש מחקר נוסף כדי להבהיר את מנגנוני ההעברה וההתמדה של HPAI H5N1 בבקר לחלב והשלכותיו על בריאות הציבור ותעשיית החלב.
לגבי המחקר
במרץ 2024, שתי פרות חולבות בוגרות של הולשטיין בטקסס, אובחנו עם זיהום בנגיף HPAI H5N1 במעבדה לאבחון וטרינרי של אוניברסיטת איווה. הפרות הראו תסמינים הכוללים הנקה מופחתת וחלב צהוב וסמיך.
האבחנה אושרה באמצעות תגובת שרשרת של תעתוק פולימראז בזמן אמת (rRT-PCR) ואימונוהיסטוכימיה בבלוטות החלב והריאות. קטעי רקמה מקובעים בפורמלין ומשובצים בפרפין של רקמות קנה הנשימה, הריאות ובלוטות החלב, כמו גם דגימות חלב, נאספו לניתוח נוסף.
קטעי רקמה אומתו כחיוביים לחומצת גרעין מטריצת הגן של נגיף שפעת A באמצעות בדיקת RNA In Situ Hybridization Assay (RNAscope), וגם נגעים מקרוסקופיים ומיקרוסקופיים נבדקו באמצעות אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית של IAV ו-rRT-PCR.
דגימות חלב עברו ציטוצנטריפוגה והוצבעו בכתם רייט שונה לצורך הערכה ציטולוגית. ספירת תאים דיפרנציאלית נקבעה בהגדלה של 1,000 × על ידי ספירת 100 תאים בעלי גרעין. לאפיון הקולטן, הוכנו קטעי בלוטות החלב המקובעים בפורמלין ומוטבעים בפרפין ונצבעו בשיטת צביעת לקטין כפולה ואימונוכימיה.
תהליך הצביעה כלל דגירה של קטעים עם לקטינים ספציפיים ו-streptavidin המצומדים עם Alexa Fluor 647, ולאחר מכן צביעה חיסונית עם נוקלאופרוטאין שפעת A (IAV-Np). צביעה אימונופלואורסצנטי רב-צבעונית בוצעה באמצעות נוגדנים נגד ציטוקרטין ומולקולת מתאם מיונן קושר סידן 1 (Iba1) (סמן מקרופאג).
השקופיות נבדקו והצטלמו באמצעות מיקרוסקופ טרינוקולרי אולימפוס המצויד במצלמת DP23 ובתוכנת CellSyns Dimension. הביקורות השליליות כללו השמטת לקטין או נוגדנים ראשוניים, וביקורות חיוביות בוצעו על רקמות חזיריות ורקמת ריאה חזירית ידועה ב-IAV.
תוצאות המחקר
שתי פרות חלב מניקות של Holstein שנגועות באופן טבעי בזיהומי וירוס HPAI H5N1 נבחרו להערכה רטרוספקטיבית. הפרות הראו ביטויים קליניים-פתולוגיים, והזיהום שלהן אושר באמצעות שיטות זיהוי ונתוני רצף שדווחו בעבר.
בדיקה היסטולוגית של בלוטת החלב גילתה דלקת שד מולטיפוקל מתונה חריפה המאופיינת בהפחתת אפיתל ודלקת נויטרופלית תוך-לומינלית. אימונוהיסטוכימיה עבור IAV-Np בבלוטת החלב הראתה פעילות אימונולוגית תוך-גרעינית ואינטרציטופלזמית בתאי אפיתל צינורית מכתשית ואינטרלובולרית. הערכה ציטולוגית של חלב מהבלוטה הפגועה מצאה דלקת נויטרופלית מתונה עד בולטת ודלקת מקרופאגית קלה התואמת עם דלקת השד.
מטרת המחקר הייתה להעריך את התפלגות קולטני SA α2-3 ו- α2-6 ברקמות הנשימה והחלב של הפרות הנגועות באמצעות היסטוכימיה של לקטינים מבוססת פלורסנט וכרומוגני.
סימון Sambucus nigra agglutinin (SNA) (לקטין הנקשר ספציפית לחומצה סיאלית הקשורה α2,6 לגלקטוז או N-acetylgalactosamine) נצפה בבלוטות תת-ריריות, בתאי גביע ובתאי חיסון תוך-אפיתליאליים ולמינים פרוריאליים של קנה הנשימה והסמפונות. Maackia amurensis lectin I (MAL-I) (לקטין הנקשר ספציפית לחומצה סיאלית המקושרת α2,3 לגלקטוז) וסימון MAL-II היה חלש עד בינוני, רב-מוקדי ונצפה באפיתל הנשימה של קנה הנשימה. בבלוטת החלב, סימון MAL-II ו-SNA באו לידי ביטוי ב-alveoli הפרשה בלתי מושפעת, כאשר SNA נצפה גם בצינורות בין-לובאריים לא מושפעים. לא נצפה סימון MAL-I או IAV-Np שניתן לגלות בחתכים של בלוטות החלב שלא נפגעו.
תיוג פלורסנטי סיפק רגישות ולוקליזציה מובהקות יותר בהשוואה למבחנים כרומוגניים מבוססי לקטין. בבלוטת החלב הנגועה נעשה שימוש ב-pancytokeratin (סמן אפיתל) וב-Iba1 להערכת התפלגות תוך-תאית של IAV-Np. תיוג משותף של IAV-Np עם pancytokeratin נצפה בתאים המצפים את הצינורות הבין-לובולריים ואת alveoli הפרשה, עם תיוג אינטנסיבי יותר באפיתל המכתשי. תאים תוך-לומינליים בתוך alveoli וצינורות הפרשה הציגו ביטוי תוך-גרעיני וגם ציטופלזמי של IAV-Np, שסומן בדרך כלל עם pancytokeratin ותאים נדירים חיוביים ל-Iba1.
תיוג IAV-Np תוך-גרעיני ממוקם במשותף עם MAL-II ו-SNA בתאי אפיתל המצפים את המכתשי הפרשה. תיוג משותף של IAV-Np ו-SNA נצפה גם בתאי אפיתל צינוריים, בעוד MAL-II לא זוהה בצינורות. תיוג MAL-I לא נמצא בצינורות הפרשה או במכתשות, מה שמונע את זיהויו עם IAV-Np.
מסקנות
לסיכום, נוכחות נגיף HPAI H5N1 בבקר, במיוחד בבלוטת החלב ובחלב, מדגישה את יכולת ההסתגלות של IAV למינים לא מסורתיים ואת הצורך במעקב פעיל. IAVs משתמשים בקולטני SA ספציפיים לזיהום מארח. IAVs של עופות מעדיפים קישורי SA α2,3, בעוד ש-IAV של יונקים, כולל אלה מבני אדם וחזירים, מעדיפים קישורי SA α2,6. מחקר זה מצא את שני סוגי קולטני ה-SA בדרכי הנשימה ובבלוטות החלב של בקר לחלב, דבר המעיד על פוטנציאל לזיהום בין מינים.
