מדענים מפתחים דרך לא פולשנית לנטר את הדינמיקה של ביטוי גנים במוח

במחקר שפורסם לאחרונה ב טבע ביוטכנולוגיה, קבוצת חוקרים הציגה שיטה לא פולשנית ורגישה לניטור ביטוי גנים במוח באמצעות כתבים מהונדסים הנקראים סמני פעילות משוחררים (RMAs), שיכולים לצאת מהמוח לדם לצורך זיהוי קל.

רקע כללי

ניטור ביטוי גנים במוח החי חיוני להבנת תפקוד המוח, התנהגות ומחלות נוירולוגיות. השיטות המסורתיות מתמודדות עם אתגרים בשל המבנה המורכב של המוח, הדורשות טכניקות לא פולשניות אך רגישות וספציפיות. ישנן שיטות שונות, כגון הדמיית תהודה מגנטית (MRI), הדמיית אולטרסאונד ומערכות אופטיות, שיש להן מגבלות כמו רגישות נמוכה וקושי בהדמיה של אזורי מוח עמוקים או הגבלה של ריבוי.

רוב המחקרים תלויים בניתוח שלאחר המוות, שאינו מסוגל לעקוב אחר שינויים לאורך זמן באותה חיה. יש צורך במחקר נוסף כדי לייעל ולאמת את השימוש ב-RMAs על פני אזורים ותנאים שונים במוח, כדי להבטיח את הישימות והאמינות הרחבה שלהם בהקשרי מחקר נוירולוגיים מגוונים.

לגבי המחקר

חוקרים מאוניברסיטת רייס ערכו מחקרים שונים על עכברים עם פרוטוקול שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים כחלק ממספר ניסויים. ניסויים אלה נעשו באמצעות עכברים זכרים ונקבות מזנים שונים, אשר נרכשו ממעבדת ג'קסון והוחזקו בתנאים מבוקרים.

השלב הראשון כלל בניית פלסמיד. החוקרים השתמשו בוקטור ספציפי וביצעו מספר הליכים, כולל עיכול, בידוד, הגברה ומיצוי של חומצה דאוקסיריבונוקלאית (DNA). הם התמקדו ביצירת מבנים שונים על ידי הכנסת רצפים שונים לעמוד השדרה של הפלסמיד. מבנים אלו כללו סינפסין-Ribosomal Mutant A של Adeno-Associated Virus-Human A (AAV-hSyn-RMA), עם וריאציות שונות, AAV-Glial Fibrillary Acidic (Gfa)-RMA, AAV-Fos protein (Fos)-RMA, ואחרים, כל אחד משרת מטרה ייחודית במחקר.

עבור ניסויים בתרבית תאים, נעשה שימוש ב-Pheochromocytoma Cell Line 12 (PC-12). אלה תורבו בסביבות מבוקרות ולאחר מכן עברו בדיקת לוציפראז במבחנה. באופן דומה, אסטרוציטים שמקורם בקליפת העכברושים תורבו והועברו כדי להמשיך בבדיקות. בשני התרחישים, הביו-לומינסנציה שנוצרה על ידי התאים שעברו טרנספקציה תועדה בקפידה.

החוקרים ערכו גם ניסויים על טיהור חלבונים, תוך שימוש בתאי Escherichia coli להמרת חלבוני RMA ולביטוי. חלבונים אלו עברו לאחר מכן תהליכים שונים, כולל צנטריפוגה, תמוגה ואלוציה, כדי להשיג את הטוהר הרצוי לשימוש נוסף.

חלק קריטי במחקר כלל ייצור וקטורי AAV. אלה נוצרו על ידי טרנספקציה של תאי Human Embryonic Kidney 293 עם תאי SV40 גדולים אנטיגן T (HEK293T) עם פלסמידים שונים ובהמשך קציר וטיהור הנגיף באמצעות סדרה של פרוצדורות מורכבות.

הזרקות סטריאוטקסיות בוצעו לעכברים כדי להחדיר חלבונים או AAV לאזורי מוח ספציפיים. תהליך ההזרקה בוצע בקפידה תוך שימוש בקואורדינטות מדויקות ובתנאים מבוקרים.

נעשה שימוש בשיטות שונות להערכת ההשפעות של החומרים שהוכנסו. אלה כללו בדיקות דם עבור מבחני לוציפראז, זמן מחצית חיים בסרום של חלבוני RMA ומתן כימיקלים. יתר על כן, הדמיה היסטולוגית וניתוח של מוחות עכברים נעשו כדי לחקור את דפוסי ההפצה וכן את ההשפעות שנרכשו מחומרים שהוזרקו.

לבסוף, החוקרים יישמו ניתוח סטטיסטי על פרשנות הנתונים שלהם. זה כלל מספר בדיקות כדי להשוות מערכי נתונים ולקבוע את המשמעות של הממצאים שלהם. התוצאות תועדו בקפידה, והדמויות נבנו באמצעות Adobe Illustrator, הממחישות את האופי המקיף של המחקר.

תוצאות המחקר

במחקר, חוקרים ערכו מספר ניסויים כדי להעריך את היעילות של RMAs בזיהוי ביטוי גנים במוח. בתחילה, RMAs נבדקו על יכולתם לעבור את מחסום הדם-מוח (BBB). זה הושג על ידי הזרקת חלבוני RMA ל-caudate putamen של מוחות עכברים וקביעת ריכוז הפלזמה.

התוצאות הצביעו על עלייה משמעותית בריכוז הפלזמה של Gaussia luciferase (Gluc)-RMA, וריאנט של RMA, אשר הצביע על כך שהעברת RMA מהמוח לדם התרחשה באמצעות מנגנון התגבש של פרגמנט (Fc) תלוי. יתר על כן, רמות ה-Gluc-RMA בפלזמה ירדו רק מעט לאורך תקופה, בעוד שבקרות הדגימו ירידה בולטת, מה שמצביע על כך שזמן מחצית החיים של סמן ביולוגי זה הוא מספר שעות ובכך מאפשר לו להצטבר בדם.

לאחר מכן המחקר חקר את in vivo זיהוי של ביטוי גנים במוח באמצעות RMAs. חוקרים הזריקו AAV המקודד הן ל-Gluc-RMA והן לחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת מקדם hSyn למוח העכבר. הם הבחינו בעליות אות ניכרות בפלזמה, מה שמצביע על היכולת של RMAs לזהות ביטוי גנים in vivo. הניסויים נערכו באזורי מוח שונים כמו ה-caudate putamen, Cornu Ammonis 1 (CA1) ו-substantia nigra.

הממצאים הראו יותר מפי 20,000 אותות גבוהים יותר ביחס לקו הבסיס בכל שלושת האזורים. בנוסף, רמות האותות נמשכו עד השבוע השלישי, אולי בגלל הפלזמה Gluc-RMA שהגיעה למצב יציב. המחקר גם הצביע על כך ש-Gluc-RMA מזהה באופן אמין כ-0.001% מהנוירונים במוח העכבר.

בהערכת רמות הביטוי הבטוחות של RMAs, המחקר התמקד בזיהוי רמות ביטוי הממקסמות את התועלת תוך מזעור תופעות הלוואי, במיוחד תגובות חיסוניות. Gluc-RMA בא לידי ביטוי ב-caudate putamen השמאלי תחת מקדם hSyn עם מינוני AAV משתנים. התוצאות הראו אותות RMA מובהקים בפלזמה עבור כל המינונים ללא אובדן עצבי משמעותי, מה שמצביע על כך שכל השפעות שליליות אפשריות של Gluc-RMA לא היו מספיקות כדי לגרום למוות נוירוני אפילו במינון הגבוה ביותר.

החוקרים עקבו גם אחר ביטוי גנים ספציפי לסוג תאי מוח. הם העבירו Gluc-RMA בשליטה כפולה של hSyn לעכברי Tyrosine Hydroxylase-Cre (Th-Cre), המבטאים Cre בנוירונים דופמינרגיים. המחקר מצא ביטויים ספציפיים של Gluc-RMA ו-GFP בתאים חיוביים ל-Th באתר ההזרקה המקומי, המדגים את יכולתו של Gluc-RMA לזהות ביטוי גנים במוח באוכלוסיות תאים עצביים קטנים ובאופן ספציפי לסוג תא.

יתר על כן, נחקרה היכולת של RMAs לעקוב אחר שינויים בביטוי של הגן המוקדם המיידי Fos, המתבטא במהירות על ידי גירוי תאי או פעילות עצבית. נעשה שימוש במודל חוץ-גופני באמצעות תאי PC-12 שעברו transfected עם Gluc-RMA מבוקר תחת מקדם Fos.

התוצאות הראו ביטוי מוגבר של Gluc-RMA ו-Fos בהשראת גורמי גדילה עצביים, כאשר אות הזוהר של מדיית התרבות עולה באופן משמעותי תוך שש שעות מרגע החשיפה, מה שמצביע על כך ש-Gluc-RMA יכול ליצור פלט אות מובחן בתגובה לשינויים בפרוטור. פעילות.

לבסוף, המחקר בחן RMAs למדידה לא פולשנית של פעילות עצבית. נעשה שימוש באסטרטגיה מותנית כפולה, המקשרת בין ביטוי Gluc-RMA לפעילות נוירונית. המחקר הדגים מדידות יחס מרובות של RMAs ואת יכולתם לדווח על פעילות נוירונית in vivo באזורי מוח ספציפיים. בנוסף, נעשה שימוש ב-Gluc-RMA לשיפור הדמיה ביולוגית (BLI), תוך הצגת עוצמת אות משופרת ומתאם עם רמות ביטוי גנים.