עמידות בפני קוטלי חרקים: כיצד עריכה גנטית אחת ביתושים מתפרצת עצמית לאורך דורות, וחותכת את העברת מלריה כמעט לאפס מבלי לפגוע בהישרדות.
זחל היתושים של אנופלס – מחקר: נהיגה באלל מגן של הגן FREP1 של היתוש כדי להילחם במלריה. קרדיט תמונה: צלם Sinhyu / Shutterstock
במחקר שפורסם לאחרונה בכתב העת טֶבַעקבוצה של חוקרים בדקה האם החלבון 1 (FREP1) הגלוטמין 224 (Q224) מעבד את אלל אנופלס סטפנסי יתושים עקשנים פלסמודיום זיהום, כימות את עלויות הכושר הכרוכות באלל זה והעריך מערכת כונן אללית מקושרת כדי להפיץ גרסא מגן זו באמצעות אוכלוסיות.
רֶקַע
כ- 600,000 איש מתו ממלריה בשנת 2023, בעיקר ילדים באפריקה שמדרום לסהרה ודרום אסיה. כלים מסורתיים, כמו רשתות מיטה שטופלו בקוטלי חרקים, ריסוס שיורי מקורה ותרופות אנטי-מלריות, מאבדות קרקע עד יתושים עמידים בקוטלי חרקים וטפילים עמידים לתרופות. טכנולוגיות הנעה גנים המפיצות אללים מועילים באמצעות אוכלוסיות יתושים מציעות פיתרון משלים ועמיד. היתוש FREP1 מסייע לטפילים לחצות את האמצע, ו- Q224 המתרחש באופן טבעי נראה מגן מבלי לפגוע בביולוגיה של יתושים. בדיקה ונהיגה בבטחה של אללים אנדוגניים כאלה עלולים להפחית את ההעברה תוך שמירה על כושר. יש צורך במחקר נוסף כדי לאמת יעילות, כושר, התפשטות והכלה.
על המחקר
באמצעות מקבצות מקובצות חזרות קצרות של פילינדרומיות מקובצות (CRISPR) וחלבון 9 (CAS9) הקשורים ל- CRISPR, הצוות יצר מולד אנופלס סטפנסי זני יתושים שנבדלו זה מזה רק בחומצת האמינו 224 של FREP1: סוג הבר (WT) לאוצין (L224) והגלוטמין המגן המגן (Q224). מדריך חומצה ריבונוקלאית (GRNA) מיקד לאתר אינטרוני 126 זוגות בסיס (BP) במעלה הזרם של הקודון, מה שמאפשר לתיקון מכוון הומולוגיה (HDR) להתקין Q224 יחד עם חלבון פלורסנט ירוק (GFP) או סמני חלבון פלורסנט אדום (RFP). הכושר הוערך על ידי אורך הכנף, פקדות, קצב בקיעת ביצים, גודל, הופעה ואורך חיים של מבוגרים במבחני הישרדות קפלן-מאייר.
יכולת וקטור נמדדה על ידי האכלת קרום סטנדרטית עם פלסמודיום falciparum (טפיל מלריה אנושי) בגמטוציטמיה נמוכה וגבוהה, ועל ידי הזנת עכברים פלסמודיום ברגהיי (טפיל מלריה מכרסמים), שכימות את הביציות ובלוטת הרוק. קלטת כונן אללים מקושרת הנושאת GRNA L224 שולבה עם VASA CAS9 לירושה של הטיה, ומחקרי כלוב רב-דוריים (10 דורות) עקבו אחר תדרי הסמן. אללים מקלטים הועמדו גנוטיפים באמצעות תגובת שרשרת פולימראז (PCR), רצף סנגר ורצף הדור הבא (NGS) כדי להעריך את התוצאות של תיקון שבירה כפולה-גדילים (DSB), כולל הצטרפות קצה לא הומולוגית (NHEJ). דוגמנות מתמטית בייסית מסיקה את שיעורי ההמרה, עלויות כושר ודינמיקה בתנאי כלוב מעבדה, מזדווגות בחופשיות.
תוצאות המחקר
על פני מבחני כושר נרחבים, האלל FREP1Q224 הטיל עלויות כושר כוללות זניחות. לא ניתן להבחין באורך האגף, הפקדות, בקיעת הביצה, הגולע והופעתה של מבוגרים מבקרות WT Leucine 224 (FREP1L224), עם רק הבדלים קלים ולא עקביים בגודל הגוף הגברי ותוחלת החיים שלא שינו ביצועים תחרותיים בכלובים רב-לאומיים. נקבות בתלות הנושאות FREP1Q224 חיו כל עוד ביקורות, ונקבות שהוזנו בדם הראו ירידה קלה באריכות החיים בהשוואה לבתולות, אך הבדלי אורך חיים צנועים אצל גברים או נקבות שהוזנו בדם לא העבירו תדרים אלל לאורך זמן.
ניסויי זיהום חשפו הגנה חזקה אצל יתושים הומוזיגוטיים. נמוך פלסמודיום falciparum Gametocytemia (0.08%), שכיחות הזיהום ירדה מכ- 80% ב- VASA CAS9 ו- FREP1L224 שולטת לכ- 30% בנתשים FREP1Q224, בעוד שמספר הביציות החציוני נפל משלוש לאפס. נטל Sporozoite בבלוטות הרוק צנח פי חמישה, החל מהדיונים מעל 4,000 לאפס. אפילו ב- Gametocytemia גבוה יותר (0.15%), המספר החציוני של הביציות ירד מכ- 32 לכל אמצע גוטן לפחות מ -10, וספורוזויטים הופחתו בחדות. נֶגֶד פלסמודיום ברגהייטפיל מכרסמים שונה, FREP1Q224 הוריד גם את ספירות הביציות החציוניות (43 עד 25) ומספרי ספורוזויט (כ -19,000 עד 11,000). עם זאת, שכיחות הביציות לא פחתה באופן משמעותי, ככל הנראה בגלל ההתאמה הלא טבעית של יתושים וטפילים, המאשרת עקבות ספקטרום רחבה. התנגדות נדרשת הומוזיגוזיות: הטרוזיגוטות (FREP1L224/FREP1Q224) לא היו מוגנות באופן משמעותי.
הכונן האללי המקושר עבד ביעילות. בבדיקות ההזדווגות הזוגיות, מדריך חומצה ריבונוקלאית L224 פלוס CAS9 המרה 50 עד 86% מהאללים FREP1L224 למקלט FREP1L224 ל- FREP1Q224 על ידי HDR, עם המרה גבוהה יותר כאשר CAS9 סופקה אימהית, המייצרת תדר אלל מגן כולל של עד 93% בדור השני. קצה לא-הומולוגי שהצטרף מוטציות היו צנועות (0–12%) ולעתים קרובות נראו מזיקות. בכלובי אוכלוסייה מזדווגים באופן חופשי שזרעו בתורם 1: 3: יחס אללי מקלט, תדירות האלל המגן עלתה מ -25 אחוזים ל 90% תוך 10 דורות. השבר של האללים של NHEJ ירד מ -5.4% לפחות מ- 0.5%, בקנה אחד עם עלויות הכושר הקשורות לגרסאות אובדן של פונקציה של חלבון 1 הקשור לפיברינוגן.
דוגמנות בייסית תמכה בסינתזה של המרה אללית גבוהה, שיעורים נמוכים של אללים התנגדות פונקציונליים ופסיפסים סטריליים קטלניים, שם הומוזיגוטות WT שנחשפו למתחם CAS9-GRNA שהופקדו באופן אימהי סובלים מעונשים כושר קשים כתוצאה ממוטציה סומטית של שני האללים FREP1, כמגישים של מנהלי העל. לבסוף, יתושים שנדגמו מכלובי הדור המאוחרים הראו דיכוי כמעט שלם של פלסמודיום falciparum ביציות (חציון אפס עד 5.5) בגמטוציטמיה נמוכה, ומאשרות כי האוכלוסייה המונעת הפכה ברובה עקשן להעברה. ראוי לציין כי האלל המגן שמר על זוגיות בתחרות ראש בראש עם כרומוזומים מולדים, תוך חיזוק כי התפשטותו משקפת את הדחף, לא יתרונות כושר נסתרים או עלויות אקולוגיות אחרות.
מסקנות
לסיכום, מחקר זה מדגים כי החלפת חומצת אמינו יחידה ב- FREP1 והטיה של ירושה באמצעות כונן אללי מקושר יכולה לערוך אנופלס סטפנסי עקשן במידה רבה לטפילי מלריה אנושיים ומכרסמים כאחד, מבלי להתייצב בעונשי כושר משמעותיים. מכיוון שגרסת המגן שומרת על ביולוגיה רגילה של יתושים, היא מציעה דרך מציאותית וידידותית לאוכלוסייה להוריד העברה, משלימה רשתות מיטה, ריסוס שיורי מקורה ותרופות אנטימלריות מאוימות כעת על ידי התנגדות. אותה מסגרת יכולה להמיר אללים עמידות בפני קוטלי חרקים בחזרה לרגישות או לפרוס גרסאות מארח מגן אחרות. מסגרות אקולוגיות, אתיות וממשלות קפדניות, כמו גם אסטרטגיות כליאה, יהיו חיוניות לפני כל פריסה.
