דרך קלאסית לצלם מבנים ננומטריים בתאים היא באמצעות מיקרוסקופים בעלי עוצמה גבוהה ויקרים ברזולוציית על. כחלופה, חוקרי MIT פיתחו דרך להרחיב רקמה לפני הדמיה -; טכניקה המאפשרת להם להשיג רזולוציה ננומטרית עם מיקרוסקופ אור רגיל.
בגרסה החדשה ביותר של טכניקה זו, החוקרים אפשרו להרחיב רקמה פי 20 בצעד אחד. השיטה הפשוטה והזולה הזו יכולה לסלול את הדרך לכמעט כל מעבדה ביולוגיה לבצע הדמיה ננומטרית.
"זה עושה דמוקרטיזציה של הדמיה", אומרת לורה קיסלינג, פרופסור נוברטיס לכימיה ב-MIT וחברה ב-Broad Institute של MIT והרווארד ובמכון קוך לחקר סרטן אינטגרטיבי של MIT.
ללא שיטה זו, אם אתה רוצה לראות דברים ברזולוציה גבוהה, אתה צריך להשתמש במיקרוסקופים יקרים מאוד. מה שהטכניקה החדשה הזו מאפשרת לך לעשות זה לראות דברים שבדרך כלל לא יכולת לראות עם מיקרוסקופים סטנדרטיים. זה מוריד את עלות ההדמיה מכיוון שאתה יכול לראות דברים ננומטריים ללא צורך במתקן מיוחד."
לורה קיסלינג, פרופסור נוברטיס, כימיה, המכון הטכנולוגי של מסצ'וסטס
ברזולוציה שהושגה בטכניקה זו, שהיא בסביבות 20 ננומטר, מדענים יכולים לראות אברונים בתוך תאים, כמו גם אשכולות של חלבונים.
"התרחבות של פי 20 מביאה אותך לתחום שבו פועלות מולקולות ביולוגיות. אבני הבניין של החיים הן דברים ננומטריים: ביו-מולקולות, גנים ומוצרי גנים", אומר אדוארד בוידן, פרופסור Y. Eva Tan לנוירוטכנולוגיה ב-MIT; פרופסור להנדסה ביולוגית, אמנויות ומדעים מדיה, ומדעי המוח והקוגניציה; חוקר במכון הרפואי הווארד יוז; וחבר במכון מקגוברן לחקר המוח של MIT ובמכון קוך לחקר סרטן אינטגרטיבי.
בוידן וקישלינג הם המחברים הבכירים של המחקר החדש, שיופיע ב שיטות טבע. הסטודנט לתואר שני ב-MIT, שיווי וואנג וטאי וון שין PhD '23 הם המחברים הראשיים של המאמר.
הרחבה בודדת
המעבדה של בוידן המציאה את מיקרוסקופ ההרחבה בשנת 2015. הטכניקה דורשת הטמעת רקמה לתוך פולימר סופג ושבירת החלבונים שבדרך כלל מחזיקים רקמות יחד. כאשר מוסיפים מים, הג'ל מתנפח ומרחיק את הביו-מולקולות אחת מהשנייה.
הגרסה המקורית של טכניקה זו, שהרחיבה רקמות בערך פי ארבעה, אפשרה לחוקרים להשיג תמונות ברזולוציה של כ-70 ננומטר. בשנת 2017, המעבדה של בוידן שינתה את התהליך כך שתכלול שלב הרחבה שני, והשיגה הרחבה כוללת של פי 20. זה מאפשר רזולוציה גבוהה עוד יותר, אבל התהליך מסובך יותר.
"פיתחנו בעבר כמה טכנולוגיות הרחבה של פי 20, אבל הן דורשות שלבי הרחבה מרובים", אומר בוידן. "אם אתה יכול לעשות את כמות ההתרחבות הזו בצעד אחד, זה יכול לפשט את הדברים לא מעט."
עם הרחבה של פי 20, החוקרים יכולים לרדת לרזולוציה של כ-20 ננומטר, באמצעות מיקרוסקופ אור רגיל. זה מאפשר להם לראות מבני תאים כמו microtubules ומיטוכונדריה, כמו גם אשכולות של חלבונים.
במחקר החדש, החוקרים יצאו לבצע הרחבה של פי 20 בצעד בודד בלבד. זה אומר שהם היו צריכים למצוא ג'ל שהוא גם סופג מאוד וגם יציב מבחינה מכנית, כדי שהוא לא יתפרק עם הרחבה פי 20.
כדי להשיג זאת, הם השתמשו בג'ל שהורכב מ-N,N-dimethylacrylamide (DMAA) ונתרן אקרילט. שלא כמו ג'לי התפשטות קודמים המסתמכים על הוספת מולקולה נוספת ליצירת קשרים צולבים בין גדילי הפולימר, ג'ל זה יוצר קשרים צולבים באופן ספונטני ומציג תכונות מכניות חזקות. רכיבי ג'ל כאלה שימשו בעבר בפרוטוקולי מיקרוסקופיה הרחבה, אך הג'לים שהתקבלו יכלו להתרחב רק פי עשרה. צוות MIT ייעל את הג'ל ואת תהליך הפילמור כדי להפוך את הג'ל לחזק יותר, ולאפשר התרחבות פי 20.
כדי לייצב עוד יותר את הג'ל ולשפר את יכולת השחזור שלו, החוקרים הוציאו חמצן מתמיסת הפולימר לפני הג'ל, מה שמונע תגובות לוואי המפריעות להצלבה. שלב זה דורש הזרמת גז חנקן דרך תמיסת הפולימר, המחליף את רוב החמצן במערכת.
לאחר יצירת הג'ל, נשברים קשרים נבחרים בחלבונים שמחזיקים את הרקמה יחדיו ומוסיפים מים כדי להרחיב את הג'ל. לאחר ביצוע ההרחבה, ניתן לתייג חלבוני מטרה ברקמה ולהדמיה.
"גישה זו עשויה לדרוש יותר הכנת דגימות בהשוואה לטכניקות אחרות של רזולוציית-על, אבל היא הרבה יותר פשוטה כשמדובר בתהליך ההדמיה בפועל, במיוחד עבור הדמיה תלת-ממדית", אומר שין. "אנחנו מתעדים את הפרוטוקול שלב אחר שלב בכתב היד כדי שהקוראים יוכלו לעבור עליו בקלות".
הדמיה של מבנים זעירים
באמצעות טכניקה זו, החוקרים הצליחו לדמיין מבנים זעירים רבים בתוך תאי מוח, כולל מבנים הנקראים ננו-עמודים סינפטיים. אלו הם מקבצים של חלבונים המסודרים בצורה ספציפית בסינפסות עצביות, המאפשרים לנוירונים לתקשר זה עם זה באמצעות הפרשת נוירוטרנסמיטורים כגון דופמין.
במחקרים על תאים סרטניים, החוקרים צילמו גם מיקרוטובולים -; צינורות חלולים שעוזרים לתת לתאים את המבנה שלהם וממלאים תפקידים חשובים בחלוקת התא. הם גם הצליחו לראות מיטוכונדריה (אברונים המייצרים אנרגיה) ואפילו ארגון של קומפלקסים של נקבוביות גרעיניות בודדות (צבירי חלבונים השולטים בגישה לגרעין התא).
וואנג משתמש כעת בטכניקה זו כדי לדמיין פחמימות הידועות כגליקנים, שנמצאות על פני התאים ומסייעות לשלוט באינטראקציות של תאים עם סביבתם. שיטה זו יכולה לשמש גם לצילום תאי גידול, מה שמאפשר למדענים להציץ כיצד חלבונים מאורגנים בתוך אותם תאים, הרבה יותר בקלות ממה שהיה אפשרי בעבר.
החוקרים מדמיינים שכל מעבדה לביולוגיה צריכה להיות מסוגלת להשתמש בטכניקה זו בעלות נמוכה מכיוון שהיא מסתמכת על כימיקלים סטנדרטיים מהמדף וציוד נפוץ כגון מיקרוסקופים קונפוקאליים ושקיות כפפות, שלרוב המעבדות כבר יש או יכולות לגשת אליהם בקלות.
"התקווה שלנו היא שעם הטכנולוגיה החדשה הזו, כל מעבדה ביולוגיה קונבנציונלית יכולה להשתמש בפרוטוקול הזה עם המיקרוסקופים הקיימים שלה, מה שיאפשר להם להתקרב לרזולוציה שניתן להשיג רק עם מיקרוסקופים מתקדמים מאוד מיוחדים ויקרים", אומר וואנג. .
המחקר מומן, בחלקו, על ידי המכון הלאומי לבריאות בארה"ב, מלגת בוגר נשיאותי של MIT, מענקי מלגת מחקר בוגר של קרן המדע הלאומית של ארה"ב, פילנתרופיה פתוחה, מיזמים טובים, המכון הרפואי הווארד יוז, ליסה יאנג, אשר עזיז, ו מועצת המחקר האירופית.
