חוקרים חושפים כיצד תאים מזדקנים יכולים להזיק ולהחלים במחלות כבד

כלים גנטיים חדשים חושפים את התפקידים הכפולים של תאים מזדקנים במחלות כבד – מקרופאגים מניעים פיברוזיס, בעוד שתאי אנדותל מתקנים נזקים, פותחים פוטנציאל לטיפולים ממוקדים.

מחקר: זיהוי תפקידים תפקודיים ספציפיים להזדקנות בין סוגי תאים. קרדיט תמונה: אור קריסטל / Shutterstock

במחקר שפורסם לאחרונה בכתב העת תָאחקרו החוקרים את התפקידים התפקודיים המגוונים של עמ' 16^Ink4a+ תאים מזדקנים על פני סוגי תאים שונים בהזדקנות, התחדשות ומחלות, תוך שימוש בכלים גנטיים חדשניים כדי להתחקות, לבטל ולתפעל תאים אלו in vivo.

רֶקַע

הזדקנות תאית היא קריטית בתהליכים כמו הזדקנות, סרטן ומחלות. המושרה על ידי מתח, הוא כרוך בעצירת מחזור התא, מעכבי קינאז תלויי ציקלין (CDK) ופנוטיפ הפרשה הקשור להזדקנות (SASP). לתאים מזדקנים יש גם תפקידים מזיקים, כמו קידום הזדקנות ומחלות, וגם תפקידים מועילים, כמו דיכוי גידול ותיקון רקמות. דרוש מחקר נוסף כדי להבהיר את תפקידיהם הספציפיים לסוג התא ולפתח טיפולים המאזנים את ההשפעות החיוביות והשליליות שלהם.

לגבי המחקר

תגובת שרשרת פולימראז גנומית (PCR) בוצעה על ידי ליטוש זנבות או רקמות של עכבר עם חיץ תמוגה ופרוטאינז K ב-55 מעלות צלזיוס למשך למעלה משש שעות. לאחר מכן בוצעה צנטריפוגה של התערובת לאיסוף הסופרנטנט, שהושקע באמצעות איזופרופנול להשגת DNA גנומי. ה-DNA הזה נשטף עם 70% אתנול והומס במים מופחתים. עכברים עברו גנוטיפ באמצעות פריימרים ספציפיים לרצף ה-knockin.

עבור ניסויי פיברובלסטים עובריים של עכברים, עוברי יום 13.5 (E13.5) עוברי טריפסין, ותאים נאספו באמצעות מסננת תאים. תאים תורבו ב-Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) ואנטיביוטיקה, עם שינויי מדיה כל 2-3 ימים. מודל פיברוזיס הכבד המושרה על ידי פחמן טטרכלוריד (CCl4) כלל מתן CCl4 תוך צפק במינונים הולכים וגדלים, ולאחר מכן איסוף כבד לניתוח. רק עכברים נקבות שימשו במודל זה כדי למנוע הבדלים בין המינים.

Steatohepatitis לא אלכוהולית (NASH) נגרמה באמצעות דיאטה חסרת כולין חומצת אמינו L במשך 12 שבועות, כאשר רק עכברים זכרים נוצלו כדי למנוע שונות הקשורה למגדר. עבור טרנספקציה קטנה של חומצה ריבונוקלאית (siRNA), תאים הועברו עם siRNA באמצעות ריאגנט Lipofectamine RNA Interference MAX (RNAiMAX), ולאחר מכן דגירה במדיום שלם המכיל FBS לפני הקציר לניתוח.

תוצאות המחקר

עמ' 16^Ink4a+המקודד על ידי CDK 2a (Cdkn2a), הוא סמן מוכר נרחב של הזדקנות תאית, חיוני בתהליכים כמו הזדקנות ומחלות. קו כתב מבוסס פלואורסצנטי בשם p16-tdTomato (tdT) פותח כדי לחקור את הביטוי שלו בסוגי תאים שונים, המאפשר רזולוציה של תא בודד של עמ' 16^Ink4a+ הַבָּעָה. אימות באמצעות פיברובלסטים עובריים של עכברים (MEFs) אישר את פנוטיפ ההזדקנות ב עמ' 16^Ink4a+ תאים עם הזדקנותם, מאופיינים בצביעה מוגברת של β-Galactosidase (SA-β-Gal) והפחתת ביטוי Ki67. בנוסף, תאי p16-tdT ביטאו רמות גבוהות של סמני הזדקנות אחרים כמו p21 ו-Interleukin (IL)-6, מה שמחזק את המהימנות של מודל זה למחקר עמ' 16^Ink4a+ הַבָּעָה.

הדמיית פלואורסצנציה של איברים שונים מעכברי p16-tdT מזדקנים גילתה עלייה בתאי tdT+ עם הגיל, במיוחד בנוירונים של קליפת המוח ובתאים אנדוקריניים בלבלב. תאי tdT+ אלו הראו פנוטיפים חזקים הקשורים להזדקנות, כגון גורמי SASP מוגברים ויכולת שגשוג מופחתת, המאשרים את אוכלוסיות תאי ההזדקנות המגוונות ברקמות מיושנות.

כדי לחקור את התפקידים של תאים מזדקנים בפיברוזיס בכבד, עכברי p16-tdT טופלו ב-CCl4, מה שגרם לפיברוזיס. העשרה של תאי tdT+ מזדקנים נצפתה באזורים פיברוטיים, במיוחד במקרופאגים ותאי אנדותל (ECs), אך לא בהפטוציטים. ציטומטריית זרימה וצביעה חיסונית אימתה עוד יותר שתת-קבוצות של סוגי תאים אלה באו לידי ביטוי עמ' 16^Ink4a+ והציג מאפייני הזדקנות. רצף RNA חד-תא (scRNA-seq) אישר את הממצאים הללו, והראה את וויסות העל של סמני ההזדקנות וגורמי SASP בעמ' 16^Ink4a+ מקרופאגים ו-ECs.

להתחקות אחר גורלו של עמ' 16^Ink4a+ תאים במהלך פגיעה ותיקון בכבד, פותחה מערכת Sn-pTracer, המאפשרת תיוג ספציפי של מקרופאגים מזדקנים ו-ECs. התוצאות גילו זאת עמ' 16^Ink4a+ מקרופאגים, שסומנו במהלך פציעה, התרוקנו במהלך התיקון, בעוד ש-ECs נמשכו והפגינו סמני הזדקנות מופחתים לאורך זמן.

בנוסף, פותח כלי גנטי חדש בשם Sn-cTracer לאבלציה של עמ' 16^Ink4a+ תאים. אבלציה של עמ' 16^Ink4a+ מקרופאגים בפיברוזיס בכבד הפחיתו באופן משמעותי את הפיברוזיס, ואילו חיסול עמ' 16^Ink4a+ ECs החמירו את הפגיעה בכבד. תוצאה דיפרנציאלית זו הדגימה כי מקרופאגים מזדקנים מקדמים פיברוזיס, בעוד ש-ECs מזדקנים ממלאים תפקיד מתקן.

לבסוף, תכנות מחדש עמ' 16^Ink4a+ ECs דרך ביטוי יתר של Kdr במודל של פגיעה בכבד הפחיתו באופן משמעותי את הפיברוזיס, והדגישו את הפוטנציאל הטיפולי של התמקדות באוכלוסיות תאים מזדקנים באופן ספציפי לסוג תא כדי לשפר את תיקון הרקמות ולהגביל את הפיברוזיס.

כלים גנטיים חדשים

המחקר הציג שני כלים גנטיים רבי עוצמה, Sn-pTracer ו-Sn-cTracer, שנועדו להתחקות ולתפעל עמ' 16^Ink4a+ תאים מזדקנים בסוגי תאים ספציפיים. Sn-pTracer מאפשר מעקב מדוייק של שושלת, בעוד ש-Sn-cTracer מאפשר אבלציה ספציפית לסוג תא, תוך התגברות על המגבלות של מודלים קודמים שחסרו ספציפיות.

מסקנות

לסיכום, מחקרים קודמים המשתמשים בפינוי מערכתי של עמ' 16^Ink4a+ לתאים חסרו סגוליות מסוג תא, והתעלמו מההבדלים בזהות התא בין הרקמות. כדי להתמודד עם זה, פותחו ארבע אסטרטגיות גנטיות למחקר ספציפי עמ' 16^Ink4a+ סוגי תאים. בפיברוזיס בכבד, מקרופאגים מזדקנים קידמו פיברוזיס, בעוד ש-ECs מזדקנים סייעו בתיקון רקמות. ביטול עמ' 16^Ink4a+ מקרופאגים הפחיתו פיברוזיס, ואילו חיסול עמ' 16^Ink4a+ תיקון ECs לקוי. תכנות מחדש של ECs עם ביטוי יתר של Kdr שיפר את תפקודם והפחית את הפיברוזיס, ומציע תובנות חשובות לפיתוח טיפולים סנוליטיים עתידיים.