במחקר שפורסם לאחרונה ב-Biomaterials, חוקרים פיתחו טיפול גנטי לא ויראלי חדש לכאבי גב דיסקוגניים (DBP) על ידי מתן גורם שעתוק מסוג התפתחותי, Forkhead Box F1 (FOXF1), תוך שימוש בשלפוחיות חוץ-תאיות מהונדסות (eEVs) לניוון. דיסק בין חולייתי (IVD) in vivo.
לימוד: טיפול גנטי מבוסס שלפוחית חוץ-תאית מהונדסת לטיפול בכאבי גב דיסוגניים. קרדיט תמונה: נטלי _ Mis/Shutterstok.com
רקע כללי
כאבי גב תחתון כרוניים (LBP) הם בעיה עולמית הולכת וגוברת עקב הזדקנות אוכלוסיות והחמרת בעיות אופיואידים. הטיפולים הנוכחיים כוללים הקלה לטווח קצר או ניתוחים יקרים, המדגישים את הצורך בטיפולים לא ממכרים ופחות פולשניים.
טכניקות ביולוגיות נוכחיות, כולל מתן גורמי גדילה, טיפולים מבוססי תאים וטיפולי מסירה גנטית ויראלית, יכולות להפחית ניוון במודלים של בעלי חיים ובני אדם.
עם זאת, דאגות כמו השפעות חולפות, יעילות ירודה לטווח ארוך ואימונוגניות מיותרת וגידוליות עשויות למנוע תרגום ישיר.
לגבי המחקר
במחקר הנוכחי, חוקרים הקימו טיפול גנטי לא ויראלי לניוון דיסק בין חולייתי (IVD) באמצעות FOXF1-eEVs.
החוקרים העבירו פיברובלסטים עובריים של עכברים ראשוניים (PMEFs) עם פלסמיד המכיל FOXF1 או pCMV6 כבקרה ואפיינו דגימות eEV באמצעות ניתוח מעקב ננו-חלקיקים (NTA).
הם העריכו את הטעינה האפקטיבית של המטען המולקולרי בתוך eEVs באמצעות תגובת שרשרת של תמלול פולימראז כמותי (qRT-PCR) ו-PCR קונבנציונלי.
ניתוח הכתם המערבי קבע FOXF1 וחלבוני EV ספציפיים בניסוחי eEV. הצוות השתמש בפלסמידים המגבירים אזורי polylinker במעלה הזרם ובמורד הזרם כדי לברר את נוכחותה של חומצה FOXF1 פלסמיד deoxyribonucleic (DNA) בתאי התורמים ויצרו eEVs.
הם בחנו את החומצה הריבו-נוקלאית השליח באורך מלא שהופקה מ-DNA פלסמיד ב-eEVs ותאי תורמים.
החוקרים יצרו שלפוחיות חוץ-תאיות עם גורמי שעתוק כדי לשחזר את תפקוד הרקמה ולשנות תגובות כאב במודל חיה של DBP.
הם הגדירו את ה-EVs להובלה והפצה של FOXF1 לדיסקים בין-חולייתיים פגומים במודל כאבי גב דיסקוגניים של כאבי גב מותניים כדי לקבוע עיכוב FOXF1 eEV על ניוון דיסק בין-חולייתי.
הצוות שילב בדיקות ביומכניות של מפרקי IVD של עכברים עם הדמיה, שינויים במטריקס חוץ-תאי (ECM) והתנהגויות כאב שהוערכו לאחר 12 שבועות כדי לאמת שינויים במבנה ובתפקוד וכאב שנגרמו מההתערבות הטיפולית.
הערכות כאב לפני הניתוח ואחרי הטיפול כללו טומוגרפיה ממוחשבת מיקרו (מיקרו-CT), הדמיית תהודה מגנטית (MRI), בדיקות מכניות, צביעת אלסיאן כחול (AB) ו-Picrosirius Red (PSR), בדיקת דימתיל מתילן ואימונוהיסטוכימיה. (IHC).
המחקר הציג טכניקה כירורגית שבה החוקרים הזריקו תת עורית Buprenorphine ER לעכברים כדי לשלוט בכאב שלאחר הניתוח.
הצוות ביצע הערכות התנהגותיות לפני הניתוח ומדי שבוע מארבעה עד שנים עשר שבועות לאחר הניתוח, תוך שימוש בשיטות שונות כגון שדה פתוח, פלטה קרה, מתליית זנב וחוט תלייה.
מבחן השדה הפתוח העריך פעילות עכבר ספונטנית; בדיקות פלטה קרה מדדו היפראלגזיה תרמית; מבחני השעיית זנב מדדו כאב צירי; ומבחני חוט תלייה מדדו חוזק.
12 שבועות לאחר הניתוח, הצוות ניתח את עמוד השדרה המותני של החיות, תוך שימוש במעקב אחר עצבי הירך והעורקים כדי לזהות את הדיסקים הבין חולייתיים בין L4 ו-L5, L5 ו-L6, ו-L6 ו-S1 IVDs. הם השתמשו ב-L5/L6 IVD כדי להעריך היסטולוגיה ולקבוע תכולת glycosaminoglycan (GAG).
תוצאות
FOXF1 eEVs הפחיתו באופן ניכר את התנהגויות הכאב תוך שחזור מבנה ותפקוד IVD, כולל גובה דיסק משופר, הידרציה של רקמות, תכולת פרוטאוגליקן ומאפיינים מכניים.
המחקר התמקד בשחרור eEV טעון FOXF1 מפיברובלסטים ראשוניים שעברו טרנספקציה עם גורם השעתוק ההתפתחותי FOXF1. RT PCR כמותי הצביע על עלייה ניכרת בתעתיקי ה-mRNA של FOXF1 ורמות ה-mRNA של FOXF1 באורך מלא בהשוואה לתאים שעברו transfected pCMV6.
טיפול ב-FOXF1 eEV עשוי להפחית את התנהגות הכאב במודל של ניקור דיסק מותני של עכבר למשך עד 12 שבועות. עכברים נקבות הפגינו זמן אחיזה גבוה יותר עבור קבוצות שטופלו ב-FOXF1 בהשוואה לקבוצה הפגועה, שנמשך לפחות 12 שבועות לאחר הטיפול.
טיפול ב-FOXF1 eEV שיפר את הידרציה והגובה של רקמת IVD בבעלי חיים פגועים ומנוונים in vivo תוך שמירה על רמות הידרציה ועוצמת דיסק IVD במשקל T2.
עם זאת, הצוות ראה גובה דיסק מופחת בבעלי חיים פצועים ובבעלי חיים שטופלו ב-pCMV6 eEV. עכברים שטופלו ב-FOXF1 eEV לא הראו ירידה בגובה הדיסק 12 שבועות לאחר הטיפול. לא היו השפעות מין על תוצאות תפקודיות.
FOXF1 eEVs החזירו את התפקוד המכאני ל-IVD פגום ומנוון in vivo. תחת לחץ צירי, IVDs שטופלו עם FOXF1 eEVs הפגינו נוקשות NZ מנורמלת גבוהה יותר מאשר IVDs פצועים.
בנסיבות זחילה, IVDs פצועים הדגימו תזוזות זחילה מנורמלות מוגברות, מה שמצביע על קשיחות אלסטית זחילה מופחתת.
הממצאים מצביעים על כך שהפחתת תכולת ה-GAG ב-IVD פגום שיפרה את ההתאמה המכנית, אך טיפול ב-eEV מנע אובדן גליקוזאמינוגליקן וכתוצאה מכך שינויים תפקודיים מכניים.
FOXF1 eEVs גרמו לשינויים מבניים ותפקודיים ב-IVD באמצעות העלאת רמות הפרוטאוגליקן וה-GAG.
סיכום
ממצאי המחקר גילו כי EV עמוסים בגורמי שעתוק התפתחותיים יכולים לטפל במחלות מפרקים כואבות כגון DBP על ידי העברת גורמי שעתוק אלה למפרקי IVD מנוונים וכואבים.
אסטרטגיה זו יכולה לסייע בהחלשת הפרעות מבניות ותפקודיות הנגרמות על ידי המחלה, תוך ויסות התנהגויות כאב על סמך מין.
החוקרים גם דגלו בשימוש בגורמי שעתוק התפתחותיים כמו FOXF1 כדי להמיר תאי NP מנוונים למצב פרו-אנבולי in vivo. יש צורך במחקר נוסף כדי לקבוע את יעילותו הטיפולית.
