במחקר שפורסם לאחרונה ב ACS Central Scienceחוקרים השתמשו בבדיקת זוהר בלתי תלויה בלוציפראז כדי לחקור האם לחלבון תסמונת הנשימה החריפה הקשה מסוג coronavirus 2 (SARS-CoV-2) ספייק (S) יש פעילות פסאודו-לוציפראז Cypridina לוציפרין.
רקע כללי
לוציפרין (מצע זוהר) ולוציפראז (אנזים) חיוניים לזיהוי ביולוגים (BL), המאפשרים זיהוי זוהר סלקטיבי ביותר של חלבוני מטרה ותאים. לוציפרין מסוג Imidzopyrazinone (IPT) נמצא במינים ימיים רבים, ואילו Cypridina לוציפראז מזרז Cypridina לוציפרין וקולנטרזין (CTZ). לוציפרין פולט אור בנוכחות לוציפראז, למרות שהוא יכול להגיב עם חלבונים שאינם לוציפראז או עם ביומולקולות אחרות.
מחקר שנערך לאחרונה הראה שנגזרת CTZ HuLumino יכולה לזהות כמותית אלבומין בסרום אנושי (HAS) עם דיוק שווה ערך למבחן אימונוסורבנטי מקושר אנזים (ELISA) תוך פחות מדקה.
לגבי המחקר
במחקר הנוכחי, חוקרים חקרו את היישום של Cypridina תגובת הזוהר החמצונית של לוציפרין, מזורזת על ידי חלבון SARS-CoV-2 S, בביוטכנולוגיה. הם דיווחו שלחלבון SARS-CoV-2 S יש פעילות פסאודו-לוציפראז נגד Cypridina לוציפרין וחקר את המבנה הכימי שלו ואת פעילות הזוהר שלו.
הצוות חקר IPT luciferins לפליטת אור באמצעות המונומר באורך מלא של חלבון SARS-CoV-2 S. הם שילבו 36 IPT לוציפרינים, כולל שני לוציפרינים מקומיים (CTZ ו- Cypridina luciferin) ו-34 אנלוגים של CTZ ידועים בעבר, עם חלבון S. באמצעות שלושת תת-יחידות החלבון S (S1, S2 ותחום הקולטנים (RBD)), הצוות זיהה פוטנציאל Cypridina רכיבי לוציפרין. הם השוו את הפרופילים הקינטיים וגזרו את ערכי Km וערכי Kcat היחסיים מעיקולי התאמת משוואות Michaelis-Menten שהופקו באמצעות עוצמת הארה ההתחלתית למשך 30 שניות.
הצוות למד את הקשר מבנה-פעילות של Cypridina אנלוגים של לוציפרין (CLAs) עם ספייק גליקופרוטאין SARS-CoV-2 כדי לקבל תובנות לגבי תגובות הזוהר בין Cypridina מצע לוציפרין וגליקופרוטאין SARS-CoV-2 S. הקבוצות הפונקציונליות, 3-אינדוליל ו-3-(1-גואנידינו)פרופיל ייחודיות ל Cypridina לוציפרין ונעדר בלוציפרינים אחרים המופיעים באופן טבעי. כדי לחקור את ההשפעות של הקבוצות הכימיות הפונקציונליות על הארה האנזימטית SARS-CoV-2 S, החוקרים סינתזו שלושה סוגי CLA על ידי החלפת קבוצת ה-NH של 3-indolyl ב-C-6 של טבעת ה-ITP בהטרואטום והסרת 3-( קבוצות פונקציונליות של 1-guanidino)פרופיל מ-C-8 תוך שימוש בפרוצדורות סינתטיות.
הצוות חקר את הזיקה המחייבת של Cypridina luciferin לחלבון S עקב הקבוצה התפקודית 3-(1-guanidino)propyl ב-C-8 באמצעות הדמיות חישוביות באמצעות Autodock Vina. הם גם חקרו האם שיטת בדיקה מבוססת כימילומינסנציה המזרזת ביו-מולקולות (BCL) המשתמשת בפעילות הפסאודו לוציפראז של חלבון S עשויה לזהות את הגליקופרוטאין הטרימרי של SARS-CoV-2 בדגימת רוק אנושית ממחלת נגיף הקורונה 2019 (COVID-19) תגובת שרשרת פולימראז (PCR) – תורם שלילי ללא עיבוד מקדים של דגימה.
תוצאות
ניתן לזהות את הגליקופרוטאין SARS-CoV-2 ספייק ברוק אנושי באמצעות שיטת בדיקה מבוססת BCL המזהה את החלבון באופן סלקטיבי ומהיר ללא צורך בעיבוד מוקדם של הדגימה. זיהוי אנזימטי של הקבוצה התפקודית 3-(1-guanidino)propyl בלוציפרין בממשקים של יחידות חלבון S הוביל לתגובת הארה. לגישת ה-BCL יש פוטנציאל להשלים בדיקות תגובת שרשרת של תעתוק פולימראז (RT-PCR) מרכזיות, אשר זקוקות למתקנים קליניים מיוחדים, אנשים מאומנים ומסגרות זמן אבחנתיות ארוכות.
SARS-CoV-2 S המונומרי פלט אור בנוכחות Cypridina luciferin (יחס אות לרעש (S/N) של 35) ולא לוציפרינים אחרים. הממצאים הצביעו על כך שלחלבון SARS-CoV-2 S יש פעילות פסאודו-לוציפראז והדגימו את היכולת של טכנולוגיה זו להשלים גישות בדיקה מרכזיות. השילוב האורתוגונלי המתאים של החלבון המונומרי SARS-CoV-2 S ו Cypridina לוציפרין הראה תגובות קינטיות מסוג הבזק, שנצפו במערכות ביולוגיות שמשתמשות ב-IPT לוציפרין, עם ירידה בעוצמת הארה של כ-23% במשך דקה אחת.
ל-IPT luciferin יש קבוצות פונקציונליות של sec-2-butyl ב-C-2, 3-indolyl ב-C-6 ו-3-(1-guanidino)propyl באתרי C-8 של טבעת ה-ITP, מה שחושף את פעילות הפסאודו לוציפראז של ה-SARS -CoV-2 ספייק גליקופרוטאין. Cypridina לוציפרין, חלבון ספייק מונומרי, הפגין יעילות גבוהה יותר לתגובות קטליטיות מאשר חלבונים מקטעים, והגביר את ערכי התחלופה האנזימטית היחסית (kcat) ביותר מ-2.6. יחידות בודדות עשויות שלא לתרום לזוהר הלוציפרין אלא לאתרי התגובה שנוצרים כאשר יחידות מתאחדות. יש לסווג את מערכת הכימילומינסנציה, המייצרת זוהר תלוית לוציפראז בנוזלים קוטביים אפרוטיים, כ-BCL על סמך עוצמות זוהר.
ה Cypridina לוציפראז (קלוק) ו ורגולה שילוב לוציפרין הפיק תשואה קוונטית ביולוגית של 30%, הגבוהה ביותר מכל מערכת BL מבוססת לוציפרין IPT, עם סגוליות תגובה. הטכניקה המבוססת על כימילומינסנציה המזרזת ביו-מולקולות מזהה את SARS-CoV-2 S כמותית באמצעות גישת "ערבב וקריאה", הכוללת הוספת חלבון הלוציפרין לחומר וניטור אות הזוהר למשך דקה אחת. גישה זו מזהה את חלבון S מהר יותר ומדויק יותר משיטת בדיקת הזרימה הצידית (LFA), המשתמשת בחומצה סיאלית קושרת חלבון S.
סיכום
ממצאי המחקר חשפו שיטה חדשה לזיהוי אנטיגנים של SARS-CoV-2 ללא שינויים גנטיים או נוגדנים. חוקרים יכלו לכמת את פעילות הפסאודו-לוציפראז של גלוקופרוטאינים ספיקים של SARS-CoV-2 ברוק אנושי. חלבון S המונומרי זוהר עם Cypridina לוציפרין, אבל חלבון S הטרימרי זקוק ליותר לוציפרין. התחליף 3-אינדוליל ב-C-6 והקבוצה התפקודית 3-(1-גואנידינו)פרופיל הם קריטיים לפעילות הארה. טכנולוגיית ניתוח החלבון החדשה יכולה לזהות חלבוני S ברוק אנושי בדקה אחת ללא הכנת דגימה.
