במחקר שפורסם לאחרונה בכתב העת טבע ביוטכנולוגיהחוקרים הנדסו חלקיקים דמויי וירוסים (eVLP) שהונדסו על ידי עורך ראשי (PE) המספקים חלבוני PE, חומצות ריבונוקלאיות מובילות PE (pegRNAs), וחומצות ריבונוקלאיות מובילות יחידות (ngRNA) כמתחמי ריבונוקלאופרוטאין (RNP).
מחקר: מהונדסים חלקיקים דמויי וירוסים לאספקה חולפת של קומפלקסים של ריבונוקלאופרוטאין של עורך ראשי in vivo. קרדיט תמונה: Andrii Yalanskyi / Shutterstock
רקע: ההבטחה של עריכת פריים
עריכת פריים היא טכנולוגיה מבטיחה לשינוי חומצה גנומית דאוקסיריבונוקלאית (DNA) שיש לה פוטנציאל לשמש לריפוי מחלות גנטיות אצל אנשים. עורכים ראשיים הם חלבונים שיכולים להחליף רצף חומצה דאוקסיריבונוקלאיות ספציפי באחר. מערכות PE מחייבות שלוש הכלאות נפרדות של חומצות גרעין ואינן תלויות בהפסקות חומצה דו-חוטית או תבניות של חומצה דו-אוקסיריבונוקלאית תורמת.
החוקרים חייבים להמציא טכניקות יעילות ובטוחות כדי לספק עורכים ראשיים ברקמות in vivo הגדרות כדי להגשים את המטרה של PE. בעוד טכניקות מסירה ויראליות כגון אדנוווירוסים ונגיפים הקשורים לאדנו (AAVs) יכולות להעביר PE in vivoטכניקות מסירה לא-ויראליות כמו ננו-חלקיקי שומנים יכולים לעקוף את החששות הללו על ידי אריזת PEs כמבטאים באופן זמני חומצות ריבו-נוקלאיות שליח.
פיתוח מערכת PE-eVLP
במחקר הנוכחי, החוקרים פיתחו מערכת VLP מהונדסת עורך ראשי כדי לספק עורכים ראשיים, כולל ngRNAs ו-pegRNAs כריבונוקלאופרוטאין.
הצוות העריך את מערכת PE-eVLP בתאי HEK293T, תאי Neuro-2a ותאי Gesicle Producer 293T לבדיקות תרבית תאים. החוקרים יצרו v3 ו-v3b PE-eVLPs עם יעילות עריכה גדולה פי 65 עד פי 170 בתאים אנושיים מאשר עיצוב eVLP של עורך בסיס שדווח בעבר. הם השתמשו ב-v1.2 prime editor-eVLPs עם חומצות ריבונוקלאיות מהונדסות PE (epegRNAs) והחליפו את חלבון PE ב-PEmax2.
אופטימיזציה ליעילות: ה-v1.2 ו-v2.3 PE-eVLPs
הצוות השתמש ב-v1.2 PE-eVLPs עם pegRNAs מהונדסים כדי להחליף את חלבון העורך הראשי ב-PEmax2, PE משופר הכולל החלפות חומצות אמינו SpCas9, מולקולת קישור אופטימלית בין תחום ה-RT, Cas9 nickase, אופטימיזציה של אותות לוקליזציה גרעינית (NLS). , ואופטימיזציה של קודונים. הם ביקשו לזהות צווארי בקבוק מכניסטיים ב-v1 PE-eVLPs, לפתור את הבעיה על ידי העברת אותות הייצוא הגרעיניים (NES) בתוך החלבון Gag והכנסת שלושה אותות ייצוא גרעיניים לפני האתר של מחשוף פרוטאז של כל תת-תחום חלבון Gag עם שני אזורים נוספים יכול לסבול החדרות גדולות לתוך MMLV Gag-Pol.
החוקרים הבחינו כי מסלולי תיקון חוסר התאמה סלולרי (MMR) יכולים להפחית את יעילות ה-PE וכי הימנעות או עיכוב של MMR משפרת את יעילות ה-PE. כדי לחקור את הפוטנציאל הזה עבור מערכות עריכה ראשוניות שנמסרו על ידי eVLP, הם השתמשו במערכת v2.3 prime editor-eVLP כדי להכניס שינויים קרובים נוספים במוקדי HEK3 ו-Dnmt1.
החוקרים בדקו האם ניתן לארוז את ה-ngRNA באותו חלקיק או בחלקיק שונה מה-epegRNA כדי למצוא את מערכת הכל-ב-אחד החלקיקית הטובה ביותר v3 PE3-eVLP. בנוסף, הם בדקו האם השינויים הללו שיפרו אספקת BE בתיווך eVLP. ההחדרה החולפת של PE באמצעות eVLPs הפחיתה את היכולת של v3 ו-v3b PE-eVLPs להקל על עריכת prime in vivo במערכת העצבים המרכזית של העכבר.
תוצאות: התקדמות בטכנולוגיית PE-eVLP
מטרת המחקר היא ליצור PE-eVLPs מהדור השלישי עם רמות רלוונטיות קלינית של עריכה ראשונית ברשתית, שיקום ביטוי חלבון והצלה חלקית של תפקוד חזותי. החוקרים מצאו ועיצבו עורכים ראשיים והנדסו ארכיטקטורות VLP, מה שהביא לשיפור יעילות PE של פי 79 בתאים מסוג neuro-2A (N2A) עכברים ושיפור של פי 170 בתאי HEK293T אנושיים בהשוואה ל-v1 PE-eVLPs. . הזרקת v3 PE-eVLP תת-רשתית אחת תיקנה מחיקת Mfrp של 4.0 bp במודל ניוון הרשתית העכברית rd6 (יעילות ממוצעת של 15%) ומוטציה של Rpe65 לשחרור חלקי של פונקציות ראייה במודל rd12 (יעילות ממוצעת של 7.2%).
חידושים מרכזיים בעיצוב PE-eVLP
אותות הייצוא הגרעיני מקדמים לוקליזציה של חלבון Gag-cargo בציטופלזמה, ו-p=ארבעת אזורי המחשוף הנוספים של MMLV פרוטאז בחלבון Gag מגבירים אפשרות פיצול לא שלם, מה שמוביל לשמירה על חלק מאותת Gag ויצוא גרעיני על ידי מטען PE. בתאי 293T של הכליה העוברית האנושית, הכנסת שלושה אותות יצוא גרעיניים בין תחומי CA ו-p12 של Gag (מיקום אות ייצוא גרעיני מספר 5) הביאה ליעילות ה-PE הגבוהה ביותר, ויצרה v2.2 prime editor-eVLP.
החוקרים השתמשו בטכניקת v2.3 prime editor-eVLP כדי להכניס תחליפים צמודים נוספים בכליה העוברית האנושית (HEK3) ו-Dnmt1, אשר שיפרו את יעילות העריכה העיקרית בשני המקרים. אריזת epegRNA לא מספקת פגעה ביעילות PE-eVLP, בעוד שתוסף epegRNA הגדיל את יעילות עריכת ה-VLP המהונדסת ביותר מפי 8.0. עם v3 PE3-eVLPs, החוקרים השיגו 2.3% עריכת קליפת המוח בתפזורת ו-36% עריכה בקרב גרעיני GFP+.
מסקנה: כיוונים עתידיים עבור PE-eVLPs
בסך הכל, ממצאי המחקר הראו ש-PE-eVLPs אופטימליים מאפשרים מתן זמני in vivo של ריבונוקלאופרוטאין ראשוני של העורך, משפר את הבטיחות ומעכבים אינטגרציה טרנסגנים אונקוגניים. גם בתרבית וגם ב-vivo, חלקיקים דמויי וירוס אלה מעבירים PE RNPs לתוך תאי יונקים. ההתקדמות האחרונה במערכות עריכה ראשוניות, כולל epegRNAs, עיצוב PEmax והימנעות מ-MMR, הביאו לתוצאות טובות יותר. In vivo, המערכות המשופרות v3 ו-v3b PE-eVLPs תיקנו מחיקות פתוגניות ברשתית העכבר והשיגו רמות עריכה שוות ערך למערכות AAV-PE משולשות במודלים של עיוורון גנטי. הדור הבא של PEs ומערכות eVLP משופרות יצטרכו עבודה טכנית נוספת.
