במחקר שפורסם לאחרונה ב-Nature Microbiology, חוקרים פיתחו גישת רצף קונצנזוס של חומצה ריבו-נוקלאית (RNA) מדויקת ממוקדת (tARC-seq) לקביעה מדויקת של תדירות וסוגי המוטציות של תסמונת נשימה חריפה חמורה בקורונה 2 (SARS-CoV-2) בתרבית תאים. ודגימות קליניות.
לימוד: רצף קונצנזוס מדויק ממוקד של RNA (tARC-seq) חושף מנגנונים של שגיאת שכפול המשפיעה על סטיית SARS-CoV-2. קרדיט תמונה: Andrii Vodolazhskyi/Shutterstock.com
רקע כללי
SARS-CoV-2 משתכפל באמצעות פולימראזות RNA תלויות RNA (RdRp), אשר נוטים לשגיאות. ניטור טעויות שכפול הוא קריטי להבנת התפתחות הנגיף, אך הגישות הקיימות אינן מספיקות כדי לזהות שינויים נדירים בחומצה ריבונוקלאית דה נובו.
במהלך מגיפת מחלת הקורונה 2019 (COVID-19), שיעורי המוטציות ב-SARS-CoV-2 נעו בין 10-6 ל-10-4 לבסיס לתא. פעילות הגהה של Exonuclease מגבירה את שיעורי המוטציות, מה שמוביל לממוצע של שתי מוטציות בכל גנום מדי חודש.
לגבי המחקר
במחקר הנוכחי, החוקרים יצרו את tARC-seq כדי לחקור את מנגנוני שגיאות השכפול המשפיעות על הסטייה של SARS-CoV-2.
גישת tARC-seq משלבת מאפיינים של ARC-seq עם טכנולוגיית לכידה היברידית כדי לשפר מטרות, ומאפשרת תחקור וריאנטים מעמיק של דגימות אלו.
החוקרים השתמשו ב-tARC-seq כדי לגלות וריאציות של RNA בזן הפראי SARS-CoV-2 המקורי (WT), גרסאות SARS-CoV-2 Alpha ו-Omicron, ודגימות קליניות ואומיקרון.
החוקרים רצפו RNA מסוג פראי SARS-CoV-2 בעקבות 4.0 מחזורים זיהומיים, ויצרו 9.0 × 105 יחידות יוצרות פלאק (pf.u.) של SARS-CoV-2 RNA. הם הוסיפו אי – קולי RNA שליח (mRNA) כנשא אנזים להכנת ספריות. לכידה היברידית זיהתה בספרייה הגנטית RNA E. coli, אותו בדקו החוקרים בנפרד והשתמשו בו כבקרות פנימיות.
כדי לחקור עוד בחירות בנתוני רצף tARC, החוקרים מיפו תדרי וריאנטים שאינם מסוג חוש, נרדפים ולא נרדפים שזוהו על ידי רצף tARC על פני חלבון mon-structural 12 (nsp12), גן קריטי המקודד ל-SARS-CoV-2 RdRp.
הם קבעו את ציוני הפעולה האבולוציוניים (EA) ותדירויות השונות עבור פולימורפיזמים חד-נוקלאוטידים (SNPs) מסוג שטויות ולא נרדפות שנמצאו ב-SARS-CoV-2 ספייק (S) ו-nsp12. הם גם חישבו את תדירות המוטציה הממוצעת של מסגרות קריאה פתוחות (ORFs) בנגיף הפראי, בחלוקה לפי סוג מוטציה ושינויים בבסיס.
החוקרים חקרו את ההפצה האקראית של וריאנטים של RNA על פני הגנום SARS-CoV-2 באמצעות הערכות מבוססות מיקום וניתוח זהות נוקלאוטידים. הם גם השתמשו ב-tARC-seq על שתי דגימות קליניות כדי לחפש מוטציות דה נובו הנגרמות על ידי זיהום ספונטני.
הם התאימו את עשרת המוטציות הנפוצות ביותר של C>TT ו-G>AA לאתרי עריכת A3A ידועים בנגיף הפראי. החוקרים בחנו את כל מופעי SID עם ≥2 נוקלאוטידים של השלמה בין אתרי התורם והמקבל במורד הזרם ב-WT, Alpha ואומיקרון. הם חקרו את השכיחות בכל הגנום של מוטציות TC>TT בתאי WT-Vero.
תוצאות
חוקרים מצאו 2.7 × 10-5 (ממוצע) טעויות דה-נובו למחזור בנגיף SARS-CoV-2, כאשר הטיות C>T לא נובעות בעיקר מהעריכת אנזים אפוליפופרוטאין B mRNA, עריכת פוליפפטיד קטליטי (APOBEC).
הם זיהו אזורים קרירים וחמים על פני הגנום, לפי ריכוז GC נמוך או גבוה, והדגישו אזורים מווסתים של שעתוק כאתרים המועדים יותר לטעויות. גישת tARC-seq מאפשרת זיהוי של מתגי תבנית כגון מחיקות, הוספות ושינויים מסובכים.
לנגיף WT יש 1.1 × 10−4 וריאציות RNA לבסיס, כאשר החלפות בסיס מהוות את הרוב (8.4 × 10−5), ואחריו תוספות (2.5 × 10−6) ומחיקות (2.1 × 10−5). מעברי G > A ו-C > T שולטים בנוף המוטציות הנגיפיות, ותורמים 9.0% ו-44% מכלל ההתרחשויות.
הספקטרום המוטציוני והתדירות של קריאות פרא מסוג SARS-CoV-2 מחוץ למטרה שונים מאלה של E. coli, מה שמראה שאירועי המוטציה הללו הם שינויים ויראליים אמיתיים ולא חפצי הכנה של ספרייה.
התפלגויות אקראיות ושיעורים דומים של כל שלושת סוגי המוטציות של nsp12 מצביעים על כך שרוב וריאציות ה-RNA שנמצאו על ידי רצף tARC היו טעויות שכפול מסוג דה נובו. החוקרים לא מצאו הבדלים בתדירויות שונות בין SNPs עם ציוני פעולה אבולוציוניים נמוכים (השפעות ניטרליות משוערות) לבין אלה עם ערכי EA גבוהים (השפעות מזיקות משוערות) על פני טווח החלפת הבסיס, מה שמצביע על כך שלבחירה יש השפעה מוגבלת.
שיעורי השונות משתנים במידה ניכרת בין המיקומים, כאשר 643 לוקוסים בכפילויות ויראליות של WT מציגות תדירות החלפת בסיס גבוהות יותר באופן ניכר ו-80 חוזרות על עצמן בשני רפליקות ה-WT.
החוקרים לא מצאו חפיפה בין נקודות חמות C>TT לריצוף tARC בתדירות הגבוהה ביותר לבין אזורי עריכת A3A בנגיף הבר. תדרי רצף tARC C>TT באזורי עריכת A3A היו נמוכים מתדרי C>TT של נקודות חמות של רצף tARC בתדר הגבוה ביותר C>TT בסדרי גודל אחד עד שניים.
המחקר הדגיש את tARC-seq, גישת ריצוף ייעודית, כדי לחקור את טעויות השכפול המשפיעות על סטיית ה-SARS-CoV-2. גישה זו קוראת באופן סלקטיבי מולקולות RNA ספציפיות כדי ליצור רצף קונצנזוס, ומאפשרת לחוקרים לזהות ולהעריך הבדלים וטעויות קלים במהלך שכפול ויראלי.
זה עשוי גם לזהות כניסות ומחיקות דה-נובו ב-SARS-CoV-2 הנובעות מזיהום בתרבית תאים, מה שמאשר את ממצאי רצף מגיפות ברחבי העולם.
המחקר גם גילה של-SARS-CoV-2 יש יכולות הגהה של אקסונוקלאז, שעשויות לסייע בהבנת התפקוד הקריטי של ExoN.
