במחקר שפורסם לאחרונה ב- כתב העת של האגודה האמריקנית לכימיהמציגים החוקרים את ספריית הפפטידים הסטריאו-גיוון הדור השני של NTB.
לימוד: מעכבי מיקוד MYC הנוצרים מספריית פפטיד דו-מחזורית סטריאו-גיוון. קרדיט תמונה: Christoph Burgstedt / Shutterstock.com
מיקוד ל-MYC
MYC, גורם שעתוק המעורב ברוב סוגי הסרטן בבני אדם, הוא יעד לא נחקר באונקולוגיה בשל אופיו הפרוע וקצב התחלופה המהיר שלו. למרות עשורים של מחקר, אין טיפול קליני בר-קיימא מכוון ל-MYC.
מחקר אחרון אחד דיווח על NT-A1, פפטיד ממוקד MYC המיוצר מספרייה מולקולרית באמצעות טופולוגיה דו-מחזורית מסוג מעין הפיך. עמוד השדרה הנוקשה של NT-A1 רגיש לסידורים מרחביים קבוצתיים פונקציונליים ומאפשר את הקישור ל-MYC, ובכך מצביע על נוף פגיעה מובהק בתוך המרחב הכימי התלת מימדי (תלת מימד).
לגבי המחקר
במחקר הנוכחי, חוקרים פיתחו ספריית פפטידים דו-מחזורית מגוונת בסטריאו כדי לחקור את האזור הכימי המגוון בתלת-ממד מעבר לזה שנחקר באמצעות מבנים קודמים של NTA.
תגובת ROM-RCM שימשה למחזור הספרייה בשלב אחד. זה הביא לפפטיד דו-ציקלי שניתן לבצע ליניאריזציה בקלות עבור ריצוף ספקטרומטריית מסה טנדם עם תהליך דיאליציה חד-שלבי.
ספרייה זו שימשה לבדיקת פפטידים דו-ציקליים המכוונים ל-MYC הנקשרים לאפיטופ E363-R378. על ידי העדפת קונפורמציות מועדפות, שאריות פרולין עשויות לסייע בפיתוח מבנים דו-מחזוריים. נעשה שימוש במולקולות בניית אקסו-ואנדו-נורבורן גזעמיות לביצוע "סריקת פרולין" באמצעות רצף הפפטידים של מודל FIVAL.
הגישה אומתה באמצעות הערכת טטרזין ופירוק אדמן או ספקטרומטריית מסה. סימולציות מולקולריות עם מולקולות מים ופפטיד FIVAL בוצעו כדי להבהיר את השפעת איזומריזם אנדו-אקסו על הגיוון המבני. גישת הבריכה המפוצלת יצרה את ספריית החלבונים הדו-מחזורית באמצעות מולקולות איזומר אקסו-ואנדו-נורבורן גזעי ליצירת המבנה הדו-ציקלי תוך שימוש ב-17 מולקולות חומצות אמינו כאבני הבניין.
בסך הכל 42 חרוזים נבחרו באקראי ולאחר מכן רצף וליניאריזציה. ספריית הפפטידים NTB נבדקה לאיתור להיטים מולקולריים קושרים ל-MYC, ולאחר מכן בוצעה הקרנת ספרייה באמצעות MYC E363-R378.
נוצרו שילובי איזומר אקסו-ואנדו-נורבורן גזעמי והוערכו לגבי יעילות הקישור שלהם ל-MYC רקומביננטי על ידי מבחני אימונוסורבנט מקושרים לאנזימים (ELISA). שימוש ב-ELISA תחרותי, נוצרו גם איזומרים Racemic NT-B2-Exo ו-NT-B2-Endo והוערכו עבור הזיקה שלהם ל-MYC.
נעשה שימוש בספקטרוסקופיה של דיכרואיזם מעגלי מבוסס טמפרטורה כדי לחקור את המנגנונים העומדים בבסיס האינטראקציות NT-B2-MYC. ניסויים בשינוי תרמי תרמי על lysates תאי U87 הוכיחו כי NT-B2R עשוי להיקשר ל-MYC בהגדרות ביולוגיות מסובכות. כדי לבדוק אם NT-B2R השפיע ישירות על פעילות MYC, בוצע רצף חומצה ריבונוקלאית (RNA-seq) של תאי U87, ולאחר מכן הערכת גנים מבוטאים דיפרנציאליים באמצעות DESeq.
ממצאי המחקר
NT-B2R דיכא ביעילות את פעילויות שעתוק MYC ושגשוג תאים. נעשה שימוש במולקולות בונות אסטר אליל ונורבורן לבניית הפיגום הדו-מחזורי. זה הוביל לזיהוי של פפטידים חדשים שנקשרים ל-MYCs עם זיקה תת-מיקרומולרית ופעילותם בתאים סרטניים. מיקום שאריות הפרולין השפיע באופן משמעותי על התשואה, כאשר מיקום שני נבחר למחקר נוסף.
הדמיות מולקולריות אטומיסטיות גילו שכל שמונת האיזומרים, המסווגים לשתי קבוצות על פי סלקטיביות האזורית שלהם, רכשו קונפורמציות יציבות במהלך זמן הסימולציה של שנייה אחת. כל איזומר הציג מספר צבירי קונפורמציה עם כיווני כיווץ טבעת ייחודיים.
הקרנת ספרייה יצרה שמונה כניסות התואמות ל-64 מבנים, רובם בעלי זיקה מחייבת ברמת המיקרומולרית ל-MYC. באמצעות מבחני שינוי תרמי של חלבון, הצוות אימת עוד יותר כי NT-B2 יכול להיקשר ל-MYC רקומביננטי ולהשפיע על היציבות התרמית שלו.
ייצור NT-B2R הניב שני איזומרים הנבדלים זה מזה במשכי השמירה, שבהם האיזומר השולט לא נפרד בתנאי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC). יכולות הקישור של איזומרי S ו-R ל-MYC היו שונות באופן משמעותי. סימולציות מולקולריות ופוסט-אנליזה גילו כי ל-NT-B2R יציבות גבוהה יותר מ-NT-B2S עקב פחות קונפורמציות וכוחות טבעת פנימית גבוהים יותר.
NT-B2R נקשר לפעילות MYC מופחתת, ובכך משנה את המאפיינים התרמיים של MYC תוך קידום קשרים ישירים בין השניים בסביבה מחייבת מאוד מסובכת. ייצור MYC וזרחון לא הושפעו מהטיפול, ובכך הובילו לפעילות מטבולית מופחתת והתפשטות בשורות תאים U87. הטיפול ב-NT-B2R יצר שינויים טראנסקריפטומיים ניכרים, עם 1,322 גנים עלו ו-704 גנים ירדו, מה שעולה בקנה אחד עם תפקידו של MYC כגורם שעתוק מאסטר.
מסקנות
ממצאי המחקר מדגישים את הזיהוי של NT-B2R, פפטיד דו-ציקלי המכוון ל-MYC, הנגזר מהספרייה הסטריאו-גיוון של NTB המשתמש בתהליכי ROM-RCM ושארית מולקולרית של נורבורן. הספרייה, חסרת עמודי שדרה הידרופוביים וטבעות טריאזול, פותחת אזור כימי חדשני.
למרות האתגרים בזיהוי מכות טהורות מבחינה אופטית, ספריית הפפטידים של NTB יכולה לשמש למטרות בלתי פתירות ולהבהרת זהות סטריאו עם התקדמות טכנולוגיות הפרדה כיראליות וטקטיקות סינתזה סטריאו-סלקטיביות.
