פרסום חדש מ התקדמות אופטו-אלקטרונית; DOI 10.29026/oea.2024.240035 דן בננוסקופיה של דלדול פליטה מעוררת מרובים עבור הדמיה ארוכת טווח של תאים חיים מרובי צבעים.
בתחום הביולוגיה של התא, מספר הולך וגדל של מחקרים מתמקדים ברשת הסבוכה של אינטראקציות בין מבנים תת-תאיים. ככלי הדמיה רב עוצמה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי בעל רזולוציה על שברה את גבול הדיפרקציה, ואיפשר לביולוגים לצפות במבנים תת-תאיים ברזולוציה ננומטרית. בין מיקרוסקופ פלואורסצנטי בעל רזולוציה-על, מיקרוסקופיה של דלדול פליטה מעורר (STED) היא אחת הטכניקות המובילות מעבר למגבלת העקיפה, והיא מבטיחה חפצים מינימליים על ידי התכונות המיקרוסקופיות המיידיות של רזולוציית העל ללא עיבוד לאחר.
בעשור האחרון, הצורך לחקור את האינטראקציות בין מבנים תת-תאיים הוביל להתעניינות גדלה ויישום של STED תאים חיים מרובים, המושגים לרוב על ידי שימוש במספר זוגות קרני עירור-דלדול. עם זאת, הגדלת מספר אלומות הדלדול לא רק הופכת את המערכת למורכבת יותר ומגדילה באופן דרמטי את עלות הבנייה, אלא גם מגדילה את הסבירות להלבנת צילום ולרעילות פוטו-ציטוטוקסית חמורה יותר, שאינה תורמת להדמיה של תאים חיים. מצד שני, השימוש בקרן דלדול בודדת יחד עם קרני עירור מרובות מגביל את טווח אורכי גל העירור הזמינים, וחלוקת הרצועה המוגבלת למספר תעלות ספקטרליות מסודרות בצפיפות והפחתת דיבור הצלב ביניהן מהווה אתגר משמעותי. נכון לעכשיו, גישה זו מוגבלת בדרך כלל להדמיה בשני או שלושה צבעים.
כתוצאה מכך, חוקרים השתמשו במידע לכל החיים של הקרינה כדי להשיג הדמיה מרובת צבעים. משך חיי הקרינה הוא הזמן הממוצע שמולקולת פלואורסצנטית מבלה במצב נרגש וניתן לנצלה כדי להבחין בין מולקולות פלואורסצנטיות שונות. עם זאת, STED רב צבעים המבוסס על משך חיים של פלואורסצנטי ישים כרגע רק לתאים קבועים בשל הקושי של (i) לסנן סמני פלואורסצנטי של תאים חיים בעלי תכונות בהירות ואנטי הלבנה המתאימות להדמיית STED, (ii) לסמן בו-זמנית מבנים תת-תאיים מרובים. בתאים חיים, ו-(iii) הפרדת בדיקות פלורסנט שונות באותה ערוץ ספקטרלי באמצעות שיטה אנליטית מתאימה. כיום, ביולוגים מתמודדים עם מחסור בשיטות יעילות לחקר הדינמיקה והתפקוד של מבנים תת-תאיים באמצעות מיקרוסקופיה STED.
בהתבסס על האתגרים לעיל, מחברי מאמר זה פיתחו ננוסקופיה מרובת מגורה של דלדול פליטה (mSTED), המאפשרת תצפית בו-זמנית על מבנים נוספים עם פוטוטוקסיות מוגבלת והלבנה מוגבלת. החוקרים בדקו סדרה של שילובי בדיקה פלורסנטים מתאימים המסוגלים לסמן מבנים תת-תאיים מרובים בו זמנית. בדיקות פלואורסצנטיות אלה של תאים חיים בעלי זהות ספקטרלית דומה הופרדו לאחר מכן על ידי ניתוח פאזור. mSTED השיגה הדמיית STED ב-5 צבעים חיים וחשפה אינטראקציות ארוכות טווח בין מבנים תת-תאיים שונים. התוצאות כאן מספקות שדרה להבנת האינטראקטום המורכב והעדין של מבנים תת-תאיים בתא חי.
החוקרים בדקו לראשונה את הביצועים של mSTED על ידי הדמיה בשני צבעים (איור 1), מה שהראה שהוא יכול להפריד בהצלחה מבנים תת-תאיים שונים וגרם ל-4% הצלבה בלבד. בהשוואה למיקרוסקופיה קונפוקלית, הרזולוציה של mSTED השתפרה באופן משמעותי (~60 ננומטר), מה שמאפשר צפייה במבנים תת-תאיים בפירוט רב יותר.
כדי לאמת את הביצועים של mSTED בהלבנת צילום וציטוטוקסיות פוטו, החוקרים ערכו ניתוח השוואתי עם mSTED ושיטות STED רב-צבעוניות קונבנציונליות (איור 2). נדרשו שני לייזרים דלדול בהדמיית STED דו צבעים קונבנציונלית. לאחר 11 דקות של הדמיה, אות הקרינה של המיקרוטובולים ירד ל-13.4% מהערך ההתחלתי, והמיטוכונדריה הפכו לצורות נפוחות ועגולות, מה שמעיד על הלבנת פוטו חמורה ופוטו-ציטוטוקסיות. לעומת זאת, mSTED דרש לייזר דלדול אחד בלבד. לאחר 11 דקות של הדמיה, אות הקרינה של המיקרוטובולים עדיין היה 31.5% וצורת המיטוכונדריה לא הראתה שינויים משמעותיים.
חוקרים השתמשו ב-mSTED להדמיה ארוכת טווח של תאים חיים, המאפשרת תצפית בו-זמנית של חמישה מבנים תת-תאיים (איור 3). המידע הגדול מספיק של mSTED רב צבעים לטווח ארוך אפשר לנו לגלות תופעות מעניינות בביולוגיה של התא. כהמחשה, מיקרו-צינוריות מחזיקות שטח מסוים מתחת לגרעין כדי שאברונים אחרים יוכלו לנוע, וביקוע והיתוך מיטוכונדריאלי התרחשו במרחב המצומצם הזה בשיתוף פעולה של ER ומיקרו-צינוריות. תוצאות אלו מדגישות את העליונות של mSTED מרובת צבעים בהדמיה ארוכת טווח של תאים חיים של מבנים מרובים, מה שמאפשר פרשנות שיטתית של רשת אינטראקציה אברון בו זמנית.
