מחקרים חדשים חושפים כיצד חילוף החומרים של חומצה רטינואית מכוונת עדינה מאפשרת לאקסולוטל לצמוח מחדש גפיים מורכבות, ולפתוח אפשרויות חדשות לרפואה רגנרטיבית.
מחקר: פירוק חומצות רטינואיות נדרש לזהות מיקום פרוקסי -דודיסטלית במהלך התחדשות גפיים אקסולוטל. קרדיט תמונה: Bigzumi / Shutterstock
במחקר שפורסם לאחרונה בכתב העת תקשורת טבעחוקרים בארצות הברית בדקו כיצד Cytochrome P450 Family 26 Subfamily B חבר 1 (CYP26B1)-חומצה רטינואית מתווכת (RA) מווסתת את זהות פרוקסיקו (PD) במהלך התחדשות גפיים אקסולוטל.
המחקר עוסק גם בשאלות בלתי פתורות לגבי אופן הקמת שיפועי RA במהלך התחדשות וכיצד מנגנונים אלה עשויים לתרגם ליישומים עתידיים לרפואה רגנרטיבית.
רֶקַע
תאר לעצמך לאבד גפה ולצפות בה צומח בצורה מושלמת, עצם על ידי עצם ומפרק לפי המפרק. אמנם זה נשמע כמו מדע בדיוני לבני אדם, אקסולוטלים (סוג של סלמנדרה) עושים זאת באופן שגרתי. הם מחדשים גפיים ברמת דיוק מדהימה, ומשחזרים את הקטעים הנכונים מהכתף (stylopod) ליד (Autopod). יכולת זו תלויה בפיצוץ, אשכול של תאים דמויי גזע ש"זוכרים "את מיקומם המקורי. RA משפיע על הזיכרון הזה, אך כיצד נשלטים על רמותיו במהלך התחדשות נותר לא ברור. הבנת בקרות אלה עשויה להפוך את הרפואה המחודשת. יש צורך במחקר נוסף כדי לפענח את המנגנונים המולקולריים המנחים את זהות המיקום. המחברים גם מציינים כי בעוד שחשיבות ה- RA בזהות עמדתית נקבעת, האם סינתזת RA מדורגת לאורך ציר הגפיים או היא אחידה ובמקום זאת נשלטת על ידי השפלה מקומית נותרה שאלה פתוחה.
על המחקר
המחקר השתמש באקסולוטלים עם גפיים קטע ברמות מוגדרות של פרוקסימלי-דיסטל (PD), כולל סטיילופוד עליון (ארה"ב), סטיילופוד תחתון (LS), זאוגופוד עליון (UZ), ו- Autopod (A), כדי לחקור איתות RA. תגובת שרשרת פולימראז תמלול הפוך כמותית (QRT-PCR), פלואורסצנט של תגובת שרשרת הכלאה בהכלאה באתרו (HCR-FISH), ורצף חומצות ריבונוקלאיות חד-תאיות (scRNA-seq) שימשו להערכת ביטוי הגנים. האנזימים והגנים המעורבים בסינתזת RA, כולל רטינלדהיד דהידרוגנז 1 (RALDH1), RALDH2 ו- RALDH3, השפלה של RA, כמו CYP26A1 ו- CYP26B1, ותגובה של RA, כולל רטוביה אלף אלפיה (RARA) וגידול חומצה רטובית) (RARG) (RARG) (RARG) (RARG) (RARG) (RARG) (RIMAM) (RAMAM) (RAMAM) (RAMS) (RIM). Blastemas Distal (DBS).
כדי לתפעל את רמות ה- RA, בעלי החיים טופלו בטלארוזול (TAL, הידוע גם בשם R115866), מעכב של אנזימים CYP26, בריכוזים של 0.1 מיקרומולרי (מיקרומטר), 1 מיקרומטר ו -5 מיקרומטר. פעילות RA נמדדה באמצעות אלמנט RA מגיב RA: שיפור חלבון פלורסנט ירוק (נדיר: EGFP). בכמה ניסויים, TAL שולבה עם Disulfiram (DIS), מעכב פאן-רלאדה, או AGN 193109 (RAA), אנטגוניסט קולטן חומצה פאן-רטינואית (RAR). הוערכה הביטוי של גנים דפוסים Meis Homeobox 1 ו- 2 (Meis1, Meis2), Homeobox A Genes Cluster (Hoxa9, Hoxa11, Hoxa13), והומובוקס קצר (Shox, Shox2). מקובצים באופן קבוע חזרות פילינדרומיות קצרות בקביעות/חלבון 9 הקשור ל- CRISPR (CRISPR/CAS9) שימש לייצור בעלי חיים של SHOX נוקאאוט (SHOX-/-) כדי להעריך את תפקידה התפקודי.
הגזמה של אמביסטומה מקסיקנום (Axolotl, גרסת לבקנים), סלמנדרה ניוטנית (Ambystomatidae). קרדיט תמונה: Guillermo Guerao Serra / Shutterstock
תוצאות המחקר
המחקר אישר כי איתות RA משתנה לאורך ציר ה- PD, עם רמות גבוהות יותר ב- PBS בהשוואה ל- DBS. ביטוי CYP26B1 היה גבוה משמעותית במזנצ'ם של DBS. לעומת זאת, MEIS1 ו- MEIS2, שהם גנים מגיבים RA הקשורים לזהות פרוקסימאלית, הועשרו ב- PBS. HOXA13 בא לידי ביטוי מאוד ב- DBS. דפוסי הביטוי הללו תואמים את עמדות קטע הגפיים ונשמרו מבחינה אבולוציונית.
עיכוב השפלה של RA עם איתות RA מוגבר, כפי שמדמיין על ידי נדיר: כתבי EGFP, וגרם לכפילויות גפיים פרוקסימליות מקטיעות דיסטליות. טיפול ב- TAL גרם ל- DBS להתחדש עם סטיילופודים או Zeugopods במקום Autopods. ב- 1 מיקרומטר TAL, 66.7% מה- DBS פיתחו כפילויות מלאות של Stylopod. לעומת זאת, גפיים קטנות באופן סמיך שטופלו באותה ריכוז TAL התחדשה כרגיל, אם כי מינונים גבוהים יותר פגעו בהתחדשות. השפעות אלה אישרו כי CYP26B1 מווסת את ריכוזי ה- RA קריטיים לדפוסים ספציפיים לקטע.
DBS שטופל ב- TAL הראה מופחת HOXA13 והגביר את הביטוי של MEIS1. רצף RNA חשף תכנות מחדש של תעתיק תלוי במינון, כאשר DBS שטופל ב- TAL אימץ פרופילי ביטוי הדומים ל- PBS שטופלו ב- Dimethyl Sulfoxide (DMSO). בין הגנים שבאו לידי ביטוי דיפרנציאל היו SHOX ו- SHOX2, שהם מגיבים RA ומועשרים ב- PBS. הביטוי של SHOX היה מתואם הפוך עם HOXA13 ושיתוף פעולה עם MEIS1, מה שמציע שזה פועל במורד הזרם של איתות RA ו- MEIS1. המחברים מציינים כי MEIS1 ככל הנראה במעלה הזרם של SHOX במפל רגולטורי זה, הנתמך על ידי ניתוח מקדם, וכי SHOX ו- HOXA13 המבטאים תאים היו בלעדיים הדדית.
מחקרים פונקציונליים המשתמשים בבעלי חיים של CRISPR/CAS9 הנגרמים על ידי SHOX הנגרמים על ידי CAS9 גילו כי SHOX-/-AXOLOTLS פיתחו סטיילופודים קיצורים וזאוגופודים, עם אוסיפיקציה אנדוכונדרלית לקויה. מכתים היסטולוגיים וניתוח המטוקסילין ואאוזין הראו כונדרוציטים לא בשלים שלא הצליחו להתבגר לעצם. עם זאת, ה- Autopod נותר לא מושפע. למרות פגמים בשלד אלה, Shox -/ – בעלי חיים התחדשו גפיים, המאשרים כי SHOX אינו חיוני להתחדשות אך הוא חיוני לדפוסי קטעי שלד פרוקסימליים. המחקר גם ציין כי ביטוי SHOX2 יכול לפצות חלקית על אובדן SHOX בהקשרים מסוימים, אם כי פגמים פרוקסימליים נמשכים, וכי היווצרות כונדרוציטים באלמנטים דיסטליים אינה תלויה ב- SHOX.
ביטוי SHOX נצפה בעיקר בתאים מזנכימליים והופעל ב- DBS שטופל ב- TAL. כאשר TAL הוחלף יחד עם DIS או RAA, נדרשים פרוקסימליזציה של DBS, והראה כי גם סינתזת RA וגם איתות בתיווך קולטנים נדרשים להשפעה זו. יתר על כן, בבעלי חיים של Shox-/-שטופלו ב- TAL, התרחשו כפילויות גפיים, אך הקטעים המשוכפלים לא היו מפותחים, מה שמצביע על כך ש- SHOX נחוץ לביצוע, אך לא ליזום, דפוסים פרוקסימליים הנגרמים על ידי RA.
בעוד שהמחקר מציג הוכחות חזקות לכך ש- CYP26B1 בתיווך RA שולט זהות מגזרת, הוא גם דן כי הרגולטורים במעלה הזרם של CYP26B1 (כגון HOXA11, HOXA13 או אותות FGF) במהלך התחדשות נותרו לקבוע.
מסקנות
לסיכום, מחקר זה מדגים כי השפלה של חומצה רטינואית תלויה CYP26B1 (RA) היא קריטית להקמת זהות PD במהלך התחדשות גפיים האקסולוטל. על ידי התאמת רמות RA בפיצוץ, CYP26B1 מאפשר הפעלה ספציפית לקטע של גנים דפוסים. רמות RA מוגברות מקדמות זהות פרוקסימלית דרך MEIS1 ו- SHOX, ואילו השפלת RA תומכת בזהות דיסטלית המסומנת על ידי HOXA13. SHOX הוא קריטי להיווצרותם ואוספיקציה של אלמנטים סטיילופודיאליים וזאוגופודיאליים אך אינו נדרש להיווצרות אוטופוד או התחדשות כוללת.
הממצאים תואמים גם מודל סף ספציפי לקטע לזהות מיקום (בדומה למודל הדגל הצרפתי), אם כי העיתון מדגיש אי וודאות בשאלה האם סינתזת RA עצמה אחידה או מדורגת לאורך ציר ה- PD. תובנות אלה מדגישות את החשיבות של חילוף החומרים המקומי של RA בהשתתפות מבנים מורכבים ועשויות ליידע אסטרטגיות התחדשות עתידיות ברפואה ובביולוגיה התפתחותית.
