במחקר שפורסם לאחרונה ב-Nature Communications, חוקרים פיתחו ערכת כלים מודולרית לביולוגיה סינתטית עבור Aspergillus oryzaeפטריית מאכל המשמשת במזונות מותססים, ייצור חלבון וחלופות בשר.
לימוד: תפטיר אכיל מהנדס ביולוגי עבור ערך תזונתי משופר ומשיכה חושית באמצעות ערכת כלים ביולוגיה סינתטית מודולרית. קרדיט תמונה: Rattia Thongdumhyu/Shutterstock.com
רקע כללי
לפי ההערכות, ייצור המזון מהווה שליש מפליטת גזי חממה ברחבי העולם, תורם לאובדן המגוון הביולוגי, הידרדרות סביבתית ומחלות חדשות.
המעבר מחקלאות בעלי חיים תעשייתית לחלופות הכרחי כדי למתן את ההשפעה הפלנטרית ולהאכיל באופן בר-קיימא את האוכלוסייה העולמית. ייצור מזון מיקרוביאלי מציע בטיחות ויעילות משופרים, בקרת ייצור מדויקת יותר והפחתת הסבל של בעלי חיים.
פטריות חוטיות הן קבוצה מגוונת של חיידקים, כולל פטריות ועובשים, והן מועילות מאוד לייצור מזון מיקרוביאלי.
חוץ מזה, יכולת ההפרשה הגבוהה שלהם באופן טבעי הופכת אותם למארחים חזקים לייצור חלבון. בנוסף, הודות למבנה החוטי שלה המחקה את מבנה שרירי החיות, ניתן לגבש ביומסה פטרייתית (מיצליה) לחלופות לבשר (מיקופרוטאין).
המחקר והממצאים
במחקר הנוכחי, חוקרים פיתחו ערכת כלים מודולרית לביולוגיה סינתטית עבור א.אוריזאהפטרייה בטוחה ואכילה עם היסטוריה של צריכה טעימה.
הם יצרו גישה אלטרנטיבית, קלה לשימוש, מקובצת, חזרות פלינדרום קצרות (CRISPR)–CRISPR הקשורות לחלבון 9 (Cas9), המשולבות בקביעות, התואמת עם ריאגנטים קיימים.
גישה זו כללה המרת קומפלקסים של ריבונוקלאופרוטאין CRISPR-Cas9 ישירות במקום קידוד של RNAs עם מדריך יחיד (sgRNAs) ו-Cas9 מפלסמיד.
יתרה מכך, תבנית ה-DNA המשמשת לתיקון שברי גדילים כפולים הכילה גן דקרבוקסילאז של אורוטידין-5'-פוספט (pyrG) סמן לבחירה חיובית ושלילית.
המערכת תוכננה כך לולאה מוצלחת החוצה pyrG יכול להתרחש רק עם שילוב תבנית הקיבוע באתר המעניין, שבו רצפים זהים של 300 bp יציגו אותה.
אינטגרציות חוץ רחמיות עקב צירוף קצה לא-הומולוגי (NHEJ) במערכת זו לא יכולים לשרוד או לשרוד על מדיה עם חומצה 5-fluororotic. מאפיין חיוני של עיצוב זה היה יכולת המיחזור של ה- pyrG סמן עם החדרה במקום הנכון.
יתר על כן, לוקוסים ניטרליים למועמדים א.אוריזאה נחקרו כדי לשלב גנים לביטוי יתר. החוקרים חקרו את האזורים הבין-גניים ב- א.אוריזאה גנום RIB40 ודירג את הביטוי של שני גנים המקיפים אותם.
נוצרה רשימה של לוקוסים מועמדים החזויים לביטוי גנים גבוה, ועשרה אזורים נבחרו לניתוח נוסף.
לאחר מכן, הצוות שילב קלטות חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת שליטה של מקדם חזק ומכונן (pTEF1) ובדק את הקרינה על הקונידיות של זנים עם לולאה החוצה.
מתוך עשרת הלוקוסים, תשעה הציגו אינטגרציה יעילה ביותר, וביטוי GFP זוהה משמונה מהם. כל הלוקוסים הפגינו ביטוי גבוה יותר מהביקורת החיובית.
לאחר מכן, החוקרים שאפו להקים מערכת ביטוי סינתטית (SES) ב א.אוריזאה. לשם כך, הם העריכו את יכולתו של גורם שעתוק סינתטי מאופיין (sTF) להניע את הביטוי של mCherry ממקדם ליבה (Cp).
הם שילבו גנטית את ה-sTF וגרמו לביטוי בסיסי נמוך תחת Cp from א' ניגר. בנפרד, קלטת mCherry עם רצפי הפעלה של 6x במעלה הזרם (UAS) שולבה במיקום גנומי שונה במעלה הזרם של ה-Cp.
הצוות צפה בהבעה של mCherry בקונידיות ובתפטיר. הן ה-sTF והן UAS נדרשו לפעילות. לאחר מכן, הצוות שאף להנדסה ביולוגית של תפטיר אכיל, תוך התמקדות בחומצת האמינו הביו-אקטיבית ארגותיונאין.
הם שיערו שניתן להגביר את ייצורו על ידי אפנון הביטוי של גנים ביו-סינתטיים אנדוגניים של ארגותיונאין ב א.אוריזאה.
אורתולוגים של Egt1 ו- Egt2, אנזימים מ Neurospora crassa מעורבים בביוסינתזה של ארגותיונאין, זוהו ב א.אוריזאה.
לאחר מכן הוחדרו האורתולוגים בלוקוסים ניטרליים; שני הגנים באו לידי ביטוי תחת מקדם דו-כיווני או בנפרד במקומות שונים. רמות ארגותיוניאין בתפטיר היו נמוכות ב-RIB40, זן הרקע.
עם זאת, הרמות שלו היו גבוהות פי 11 ו-21 בזני פרומטור דו-כיווני ונפרד בהשוואה ל-RIB40. רמות ארגותיוניאין בכתם מקדם דו-כיווני היו דומות לאלו שבפטריות צדפות. לעומת זאת, רמותיו היו גבוהות פי 1.5 בזן הפרומוטור הנפרד.
לא היו הבדלים בתכולת החלבון בין זנים מהונדסים לבין זנים מסוג פרא. עם זאת, נצפה פגם קל בגדילה עם ייצור יתר של ארגותיונאין.
לאחר מכן, החוקרים יישמו את הכלים הללו כדי לשפר את התכונות התחושתיות של הביומסה האכילה. הם מכוונים לביו-סינתזה של heme, שכן heme נותן לבשר את הצבע והטעם (אדום) שלו בבישול.
הם זיהו גנים ביו-סינתטיים פוטנציאליים של heme א.אוריזאה והתמקד בביטוי של חמישה אנזימים חזויים מגבילי קצב. בנוסף, שני עותקים של להמוגלובין סויה באו לידי ביטוי כשקיעת heme פוטנציאלית, מכיוון שרמות גבוהות של heme חופשי יכולות להיות ציטוטוקסיות.
הביומסה של הזן המהונדס הייתה גבוהה פי ארבעה מזו של הזן הלא מהונדס.
עם הקטיף, הביומסה הייתה אדומה בהשוואה ל-off-white ב-RIB40. הבדל צבע זה נמשך לאחר הבישול, והגביר את המראה דמוי הבשר של הביומסה הפטרייתית.
המיקופרוטאין המהונדס הכיל את כל חומצות האמינו החיוניות. תכולת החלבון או תפוקת הצמיחה לא היו נמוכים יותר בזן המהונדס.
מסקנות
החוקרים פיתחו ערכת כלים סינתטית לשילוב וויסות גנים ומסלולים. הם מינפו את ערכת הכלים הזו והנדסו א.אוריזאה מיקופרוטאין לייצור (יתר) של ארגותיונאין ברמות גבוהות בהרבה מאשר במקורות תזונתיים טבעיים, כלומר, פטריות.
בנוסף, התפטיר תוכננו לייצור יתר של heme עבור צבע וטעם משופרים. יש לציין, עבודה זו מייצגת אב טיפוס מוקדם; נדרשות הערכות נוספות של תכונות תחושתיות, בטיחות מזון, קבלת צרכנים ונוף רגולטורי.
