עמידות לאנטיביוטיקה היא דאגה עולמית המאיימת על יכולתנו למנוע ולטפל בזיהומים חיידקיים אצל בני אדם ובעלי חיים. כדי לפקח טוב יותר על הופעתה והתפשטות ההתנגדות, החוקרים במכון קרל ר. ווזה לביולוגיה גנומית פיתחו שיטת מטגנומיקה מועשרת ב- CRISPR למעקב משופר של גנים עמידות לאנטיביוטיקה, ARG, בשפכים.
בעוד שאנטיביוטיקה הם כלים מודרניים חזקים למאבק בזיהומים, חיידקים משתנים ומסתגלים לאורך זמן בתגובה לחשיפה לאנטיביוטיקה, ולכן ירידה ביעילות. שימוש יתר נרחב ושימוש לרעה באנטיביוטיקה בתעשיות הבריאות והמזון מאיצות עוד יותר בעיה זו.
מעבר לחשיפה ישירה לאנטיביוטיקה, עמידות מועברת גם בין חיידקים שונים באמצעות העברת חתיכות קטנות של DNA חיידקי הנקראים גנים עמידות לאנטיביוטיקה. ישנם מעל 5000 ארגונים שזוהו, וניתן למצוא גנים אלה בדגימות קליניות, כמו גם גופי מים, שמקורם בבתי חולים, חוות ומערכות ביוב.
ארגונים יכולים להפחית את כוח מציל החיים של תרופות המשמשות לטיפול בזיהומים חיידקיים. איתור שפכים של ARG עם משמעות קלינית מאפשר לרשויות ורופאי בריאות הציבור לצפות למה שמסתובב בקהילות. "
הלן נגוין (IGOH), פרופסור להנדסה אזרחית וסביבתית, אוניברסיטת אילינוי אורבנה-שמפיין
שפכים מכילים ארגונים רבים שונים המעורבים יחד עם חומר גנטי ממקורות שונים כולל בני אדם, וירוסים וחיידקים. מכיוון ש- ARGs מהווים רק אחוז זעיר מכלל תוכן ה- DNA, חשיפתם בדגימות שפכים דורשת שיטות גילוי רגישות. הטכניקה הנפוצה ביותר היא תגובת שרשרת פולימראז כמותית, QPCR. שיטה זו משתמשת במדריכי RNA הנקראים פריימרים כדי לזהות את רצפי ה- DNA הספציפיים של ARGs ידועים, אשר לאחר מכן מוגברים לגילוי.
"QPCR היא שיטה רגישה שאנשים רבים בבריאות הציבור מאומנים היטב לעשות זאת, אך היא דורשת תכנון ותוקף פריימר שהוא זמן רב מאוד", אמר יוקינג מאו, דוקטורנט להנדסה אזרחית וסביבתית שהיה מחבר הראשון בעיתון. "מכיוון ש- QPCR משמש לשלוף רצפי גנים ממוקדים, כל שאר החומר הגנטי במדגם נותר לא ידוע לחלוטין."
השיטה השנייה, Metagenomics, אינה רגישה כמו QPCR, אלא לוכדת סיפור שלם יותר של המידע הגנטי הכלול במדגם. Metagenomics כרוך בפירוק כל ה- DNA המדגם למיליוני שברים קטנים יותר, אשר במקביל רצפים באמצעות טכנולוגיות רצף מהדור הבא. אלגוריתמים חישוביים מחברים יחד את רצפי ה- DNA המלאים להשוואה בין מסדי נתונים כדי לקבוע את זהותם.
"ARGS מהווים פחות מאחוז אחד-ככל הנראה קרוב אפילו יותר ל- 0.1 % מ- DNA במדגם. בשיטות מטגנומיקה סטנדרטיות, 99.9 % מה- DNA שהתגלה אינו קשור ל- ARGS", אמר מאו.
כדי להעשיר את כמות השברים הקשורים ל- ARG בדגימות, מאו, נגוין ומשתף הפעולה שלהם, ג'ואנה שיסלר, המזוהה עם המחלקה למיקרוביולוגיה באילינוי, מינפה את מערכת CRISPR-CAS9-כלי יעיל ביותר לעריכת גנים. ה- DNA מקוטע במיקומים אקראיים בעת שימוש בשיטות Metagenomics סטנדרטיות, אך שילוב של CRIPSR-CAS9 מאפשר פיצול ממוקד בתוך ARGS. על ידי תכנון מאגר של 6010 RNA מדריכים שונים שיכולים להיקשר באופן ספציפי ל- DNA באתרים שונים שנמצאים בארגונים, ניתן היה להפנות את חלבון CAS9 לחתוך במקומות אלה.
"שיטת ה- CRISPR החדשה שלנו מגדילה את שפע שברי ה- ARG במדגם, מה שמגדיל את הסיכויים שלהם לקרוא ולאתר. ל- CRISPR יש גם פוטנציאל טוב יותר למבחנים מרובים מאשר משהו כמו PCR מכיוון שהאינטראקציה המולקולרית פשוטה ופשוטה עבור CRISPR", אמר מאו.
השיטה החדשה שלהם הורידה את גבול הגילוי של ARGs בסדר גודל, בין 10-4 ל- 10-5, בהשוואה למטגנומיקה סטנדרטית ומצאו 1189 יותר ארגונים ו -61 משפחות ARG נוספות שהן נמוכות בשפע בדגימות שפכים.
כסטודנטית בוגרת שנה שישית, MAO בנתה את הפרויקט הזה מהמכשולים המדעיים המתקרבים ולמידה טכניקות חדשות רבות לאורך הדרך. היא אמרה, "בפעם הראשונה שקיבלתי את תוצאות הרצף, מעולם לא ציפיתי כמה רגיש יותר זה ישווה לשיטה הרגילה-היא גילתה הרבה יותר ארגונים ממה שחשבנו שזה יקרה. אחרי שסיימתי את הפרויקט, אני מרגיש שגדלתי."
אך בעוד שעבודה זו עטופה, מאו ונגוין כבר רודפים מספר כיוונים חדשים, כולל הרחבת היישומים של השיטה המטגנומית שלהם CRISPR-CAS9 למגוון רחב יותר של דגימות סביבתיות ושימוש בתוצאות שלהם כדי להנחות את העיצוב של פריימרים חדשים של QPCR.
