במחקר שפורסם לאחרונה בכתב העת טֶבַעמדענים השתמשו במודלים של עכברים כדי לבדוק אם in vivo השתקת גנים מתקיימת לאחר מסירה חולפת וביטוי של מדכאי שעתוק מהונדסים על ידי מיקוד לגן המעורב בשמירה על הומאוסטזיס של כולסטרול.
מחקר: השתקת גנים עמידה ויעילה in vivo על ידי עריכת אפיגנום פגע וברח. קרדיט תמונה: ART-ur / Shutterstock
רקע כללי
שיטה שמבטיחה הרבה בטיפול בהפרעות גנטיות היא עריכה אפיגנטית, שבה ניתן להשתיק גנים מבלי לשנות את רצף החומצה הדאוקסיריבונוקלאית (DNA) העיקרית שלהם. עריכת אפיגנום כוללת עורכים מעצבים עם תחומי אפקטור המתקבלים מדכאי תעתיק המופיעים באופן טבעי וממוקדים לתחומים ניתנים לתכנות מחייבי DNA. תחומים כאלה הקשורים ל-DNA כוללים חלבוני אצבע אבץ (ZFPs) ואפקטורים דמויי מפעילי שעתוק (TALEs).
מדכאי שעתוק מהקופסה הקשורה ל-Krüppel או ממשפחת KRAB נחקרו בהרחבה לצורך השתקת גנים והפגינו את היכולת לגרום לדיכוי גנים חזק בשניהם in vivo ו בַּמַבחֵנָה מחקרים בסוגי תאים שונים. השתקת גנים זו על ידי עורכים מבוססי KRAB מתבצעת באמצעות אנזימים משנים היסטון. עם זאת, השימוש בעורכים מבוססי KRAB בתאים סומטיים לא היה יציב, והשימוש בוקטורים ויראליים לביטוי יציב של עורכים אלה מגביר את הסכנה למוטגנזה.
לכן, צוות חוקרים זה פיתח מדכאי שעתוק מהונדסים המכילים, יחד עם KRAB, את התחום הקטליטי של האנזים דה נובו DNA-methyltransferase A (DNMT3A) והקופקטור שלו דמוי DNMT3A, שיכולים להשתיק באופן ספציפי ועמיד גנים אנדוגניים.
לגבי המחקר
במחקר הנוכחי, החוקרים חקרו האם הביטוי החולף של מדכאי תעתיק מהונדסים in vivo יכול לגרום להשתקת גנים מתמשכת. לשם כך, הם השתמשו במודלים של עכברים והתמקדו ב Pcsk9 גן, המעודד פירוק קולטני ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה על קרום הפלזמה של הפטוציטים של הכבד, ובכך שולט ברמות הכולסטרול במחזור.
מדכא התעתוק המהונדס מכוון לאזור המקדם-משפר של הגן במהלך השתקה אפיגנטית ומסיר ומפקיד סימני היסטון מפעילים ומדכאים באזור. בנוסף, מתילציית ה-DNA באתרים שבהם מתרחשים בסדרות זוגות של נוקלאוטידים של ציטוזין וגואנין, הידועים כאיי CpG, עולה גם עקב פעולתם של מתילטרנספראזות אנדוגניות. תהליך זה קובע את עמידות ההשתקה האפיגנטית.
כאן, החוקרים הנדסו קו תאי הפטומה מעכברים שדיווחו על פעילות שעתוק ברמת תא בודד עבור Pcsk9 גֵן. שורת תאים זו שימשה לבחירת שילוב מדכא התעתוק המשולש עבור שלושת הסוגים של פלטפורמות תחום קושרי DNA הניתנות לתכנות המכוונות לאיי CpG המכילים את Pcsk9 מְקַדֵם. שלוש פלטפורמות התחום המקושרות ל-DNA הניתנות לתכנות כללו ZFPs, TALEs ו-Clustered Clustered CRISPR-repetitives (CRISPR) הקשורים בחלבון 9 (dCas9).
חלקיקי ליפידים הנושאים את חומצת ה-Ribonucleic שליח העורך (mRNA) ניתנו לעכברים. דגימות פלזמה מעכברים שטופלו נותחו כדי לקבוע את רמות החלבון PCSK9. בנוסף, דגימות DNA גנומי שימשו עבור in vivo ניתוחים מולקולריים והפטוציטים מטוהרים שימשו לכימות יעילות בעריכה ועריכה אפיגנומית באמצעות ריצוף עמוק ממוקד או מבחן זיהוי אנדונוקלאז T7.
יתרה מזאת, השילוב של מדכא תעתוק משולש הומר לדיכוי תעתוק מהונדס מפותח – מולקולת הכל-באחד כדי להפחית את המורכבות המולקולרית של הפלטפורמה.
תוצאות
התוצאות דיווחו ש-ZFPs נבחרו כפלטפורמת תחום מחייב ה-DNA הניתנת לתכנות, אשר פעלה בצורה היעילה ביותר עבור השתקה אפיגנטית של Pcsk9 גן בעכברים. יתר על כן, מתן אחד של ה-mRNA העורך בתוך ננו-חלקיק שומנים הפחית בהצלחה את רמות החלבון PCSK9 בפלזמה בחצי, והשפעה זו נשמרה קרוב לשנה בדגמי העכברים.
למרות ההתחדשות הכפויה של הכבד בעכברים אלה באמצעות כריתת כבד חלקית, השתקת הכבד Pcsk9 הגן וסימני ההיסטון הדכאוני האפיגנטי נמשכו, מה שמצביע על כך שהמצב האפיגנטי שהותקן על ידי מדכא התעתוק המהונדס היה בר תורשה. יתר על כן, לדיכוי התעתוק המהונדס שהתפתח, הנקרא EvoETR, היה פרופיל סגוליות גבוה, והירידה ברמות החלבון PCSK9 במחזור היו דומות לתוצאות משיטות עריכת גנים קונבנציונליות.
בהשוואה להפרעות חומצה ריבונוקלאית (RNAi), שיטת השתקת גנים זו נמצאה יעילה ובת קיימא יותר שכן נדרשה רק מתן אחד להשפעה של שנה, בעוד ש-RNAi דרש מספר מנות. לשימוש ב-EvoETR היה גם יתרון נוסף בכך שהוא לא גורם להפסקות ב-DNA, בניגוד לשיטות אחרות לעריכת גנום, מניעת גנוטוקסיות.
מסקנות
בסך הכל, הממצאים הראו שהשימוש בשילוב מדכאי תעתיק מהונדסים הניתנים לתכנות, במיוחד ה-EvoETR הפשוט והכל-באחד, השתיק בהצלחה את Pcsk9 הגן בעכברים והפחית את רמות הפלזמה במחזור של חלבון PCSK9 במשך קרוב לשנה. שיטה זו עוקפת את התהליך הגנוטוקסי של גרימת הפסקות DNA ששיטות עריכת גנים אחרות דורשות. תוצאות אלו מדגישות את הפוטנציאל in vivo יישומים טיפוליים של השתקה אפיגנטית.
