במחקר שפורסם לאחרונה בכתב העת טבע הנדסה ביו-רפואיתחוקרים פיתחו שיטה למדידת שמירה או אובדן של פעילות פפטיד אנטי-מיקרוביאלי (AMP) עבור אלפי גרסאות של רצף פפטיד.
AMPs הם פפטידים שנשמרו מבחינה אבולוציונית הנלחמים בפתוגנים. בדרך כלל, AMPs הורגים חיידקים על ידי שיבוש קרום התא שלהם. עם זאת, AMPs רבים מציגים קשיים להבדיל בין ממברנות תאי חיידקים ויונקים. שיטות קונבנציונליות להערכת גמישות וחשיבות שאריות AMP גוזלות זמן ומוגבלות לכמה גרסאות.
יתר על כן, גישות חדשות יותר, כגון סריקת מוטציות עמוקה, המאפשרת הערכה בקנה מידה גדול של מיליוני מוטציות, לא זכו להצלחה או בשימוש נרחב עם AMPs. מחברי המחקר פיתחו תצוגה אנטי-מיקרוביאלית מקומית על פני השטח (SLAY), שיטה חדשנית עם תפוקה גבוהה לבחינת בו-זמנית את הפוטנציאל האנטיבקטריאלי של מאות אלפי פפטידים סינתטיים.
מחקר: סריקת מוטציות עמוקה ולמידת מכונה לניתוח תכונות פפטיד אנטי-מיקרוביאליות המניעות את סלקטיביות הממברנות. קרדיט תמונה: Zapp2Photo / Shutterstock
המחקר והממצאים
במחקר הנוכחי, חוקרים פיתחו SLAY מוטציה עמוקה (dmSLAY) כדי להעריך כיצד אלפי שינויים של חומצות אמינו ל-AMP ידוע, פרוטגרין 1 (PG-1), משפיעים על פעילותו. הם תכננו ספריית מוטציות עמוקה של גרסאות PG-1, המקודדות 7-12 מוטציות בכל מיקום ו-1-9 שינויים לכל וריאנט. בסך הכל, הספרייה כללה 7,105 רצפים ייחודיים. לאחר מכן, הספרייה שובטה לפלסמיד תצוגה על פני השטח והומרה לתוך אי קולי W3110.
בדיקת SLAY של הספרייה זיהתה 1,940 וריאנטים לא פעילים, בעוד ש-1,203 וריאנטים נחזו כבעלי פעילות אנטי-מיקרוביאלית. לאחר מכן, 40 וריאנטים סונתזו, ונמדד הריכוז המעכב המינימלי שלהם (MIC) כנגד אי – קולי W3110. נעשה שימוש בעקומת מאפיין תפעול של מקלט כדי לקבוע חתכים אופטימליים עבור גרסאות לא פעילות ופעילות על סמך ציוני MIC ו-log2 (שינוי קיפול).
מעניין לציין כי ציוני log2 (שינוי פיפול) לא היו בקורלציה עם עוצמה אנטיבקטריאלית, אם כי ציון חיובי או שלילי ניבא ברמת דיוק של 86% אם וריאנט איבד או שמר על פעילות אנטי-מיקרוביאלית. זה כלל 16 תחזיות מדויקות עבור גרסאות של שארית בודדת, מה שמצביע על כך ש-dmSLAY היה מדויק מאוד בתחזיות. יתר על כן, שינויים בשאריות באזורי הזנב של PG-1 שמרו על פעילות, בעוד שרוב השינויים בשאריות באזורי ה-β-sheet גרמו לאובדן פעילות.
באופן עקבי, גרסאות מרובות שאריות שחזו לאבד פעילות היו עם מוטציות באזורי ה-β-sheet, בעוד שלאלה ששמרו על פעילות היו שינויים באזור הזנב. לאחר מכן, בוצעה ספקטרוסקופיה של דיכרואיזם מעגלי (CD) כדי לבחון שינויים במבנה משני של גרסאות עם ובלי הליפופוליסכריד (LPS), המחקה את קרום החיידק. ללא LPS, לא היה מתאם בין ספקטרום MIC ו-CD.
עם זאת, עם LPS, גרסאות עם ספקטרום קרוב יותר לזה של PG-1 מקורי (PG-1.0) היו חזקות יותר. לאחר מכן, הצוות ניתח את הפעילות ההמוליטית של גרסאות PG-1. לא נצפה מתאם בין אחוז המוליזה לבין ספקטרום CD ללא LPS. כמו כן, בנוכחות LPS, גרסאות המוליטיות שמרו על מבנה משני קרוב ל-PG-1.0.
חוץ מזה, הצוות הכפיל את אחוז המוליזה וה-MIC כדי ליצור ציון סלקטיביות עבור כל וריאנט. גרסאות עם ציון סלקטיביות נמוך יותר היו סלקטיביות יותר מבחינה חיידקית. ציוני סלקטיביות של גרסאות PG-1 הושוו ל-PG-1.0. השוואה זו זיהתה חמש גרסאות עם סלקטיביות ממברנה מוגברת. יתרה מכך, מבחני ספיגת פרופידיום יודיד (PI) בוצעו כדי לקבוע אם לווריאציות סלקטיביות יש את המנגנון המדויק של תמוגה ממברנה כמו PG-1.0.
אי – קולי שטופלו ב-PG-1.0 הראו ספיגת PI חזקה. באופן דומה, וריאנטים סלקטיביים הפגינו ספיגה חזקה של PI, מה שמצביע על כך שלוריאנטים יש כנראה מנגנון תמוגה דומה. יתר על כן, הווריאציות הסלקטיביות היו ספציפיות יותר פי 1000 לממברנות חיידקיות מאשר קרום תא אריתרוציטים. הספציפיות הגבוהה הזו מדגישה את הפוטנציאל הטיפולי שלהם.
החוקרים אימנו שלושה מודלים של למידת מכונה (ML) על מערך נתונים ביוכימי. מודלים שימשו כדי לזהות את הפרופילים המוטציוניים המפחיתים את רעילות היונקים (המוליזה < 2%), מגבירים את הספציפיות של החיידקים עם לוג (ציון סלקטיביות) < 0.5, או שיש להם סבירות גבוהה להיות חזקים (MIC ≤ 8 מיקרוגרם/מ"ל) בנפרד. בעוד שהמודלים סיפקו מידע על האופן שבו רצף PG-1 השפיע על מאפיינים ביוכימיים ספציפיים בנפרד, הם לא יכלו לבחור גרסאות חזקות במיוחד הספציפיות לממברנות של יונקים או חיידקים.
לכן, הצוות שילב את המודלים וזיהה למעלה מ-95,000 רצפים העוברים את שלושת החתכים. הם הבחינו שהפחתת הידרופוביות באזורי ה-β-sheet שיפרה את הספציפיות של ממברנה חיידקית. לעומת זאת, הגברת הידרופוביות באזורי הלולאה והזנב, במיוחד עם טריפטופן, והגדלת המטען הכולל שיפרו את הספציפיות של קרום היונקים.
כדי לאמת את הממצאים הללו, נבחרו שלושים ושתיים גרסאות שצפויות להיות סלקטיביות חיידקית. מתוכם, 75% מהווריאציות היו פעילות, כולן עם ציונים סלקטיביים משופרים ביחס ל-PG-1.0. יש לציין כי תחזיות ML עלו על dmSLAY בזיהוי גרסאות לא רעילות וסלקטיביות לממברנה תוך שמירה על רמת דיוק דומה בחיזוי העוצמה והפעילות האנטיבקטריאלית.
לאחר מכן, הצוות מדד את הרעילות של גרסאות ה-ML וה-dmSLAY הטובות ביותר ביחס לקוליסטין (AMP קליני) ו-PG-1.0. תאי HEK293 טופלו עם כל AMP, ונמדדה ספיגתם של SYTOX Green, צבע אטום לממברנה. התוצאות הראו שלתאים שטופלו בווריאציות סלקטיביות חיידקית הייתה ספיגת צבע פחותה משמעותית מאלה שטופלו ב-PG-1.0. יתרה מכך, לאלו שטופלו ב-bsPG-1.2 (נבחר ML) הייתה פחות ספיגת צבע מאשר קוליסטין, מה שמרמז על פחות ציטוטוקסיות יחסית.
יתרה מכך, PG-1.0 וגרסאות סלקטיביות חיידקית לא הושפעו מביטוי הגן הנייד עמידות קוליסטין. לבסוף, החוקרים חקרו את המינון המקסימלי הנסבל (MTD) של PG-1 ו-bsPG-1.2 בעכברים. ה-MTD של bsPG-1.2 היה גבוה פי חמישה מזה של PG-1, מה שמצביע על כך ש-bsPG-1.2 היה פחות רעיל באופן משמעותי בעכברים. בנוסף, bsPG-1.2 הפגין פעילות אנטיבקטריאלית בעכברים שנדבקו ב-Acinetobacter baumannii AB5075.
מסקנות
יחד, dmSLAY הציע שיטה מהירה עם תפוקה גבוהה כדי לקבוע גמישות וחשיבות של שאריות מיקומיות ולחזות כיצד מספר שינויים ברצף במקביל משפיעים על פעילות אנטי-מיקרוביאלית. בנוסף, ML אפשרה בדיקה וירטואלית של 5.7 מיליון גרסאות עבור סלקטיביות ממברנה, פעילות אנטי-מיקרוביאלית ורעילות יונקים. אסטרטגיה זו יכולה להיות מיושמת על מספר רב של AMPs כדי לשרטט את הכללים המסדירים את סלקטיביות הממברנה, מה שיכול להודיע על העיצוב הסינתטי של פפטידים טיפוליים. לממצאים אלו יש השלכות משמעותיות על פיתוחם של טיפולים אנטי-מיקרוביאליים חדשים עם רעילות מופחתת וסלקטיביות מוגברת.
