מערכות CRISPR-Cas, מערכות הגנה בחיידקים, הפכו למקור שפע של טכנולוגיות לאבחון מולקולרי. חוקרים במכון הלמהולץ לחקר זיהומים מבוסס RNA (HIRI) בווירצבורג הרחיבו את ארגז הכלים הנרחב הזה. השיטה החדשה שלהם, הנקראת PUMA, מאפשרת זיהוי של RNA עם נוקלאזות Cas12, המכוונות באופן טבעי ל-DNA. PUMA מבטיחה מגוון רחב של יישומים ודיוק גבוה. הצוות פרסם את תוצאותיו בכתב העת Nature Communications.
חיידקים פיתחו מנגנוני הגנה מיוחדים כדי להגן על עצמם מפני וירוסים, שבשום אופן לא מדביקים רק בני אדם. כחלק ממה שנקרא CRISPR-Cas מערכות אלו, חומצה ריבונוקלאית של CRISPR (crRNA), המשמשת כ"RNA מנחה", מזהה אזורים של גנום זר, כמו DNA ויראלי.
הגרעין הקשור ל-CRISPR (Cas), המכוון על ידי crRNA, הופך אותו ללא מזיק על ידי חיתוך זה כמו זוג מספריים. בני אדם ניצלו אסטרטגיה זו: "CRISPR, המכונה לעתים קרובות 'מספריים גנים', הוא הבסיס לטכנולוגיות מולקולריות רבות", אומר צ'ייס בייזל, ראש המחלקה לביולוגיה סינתטית של RNA במכון הלמהולץ לחקר זיהומים מבוסס RNA (HIRI). ) בווירצבורג. המכון הוא אתר של מרכז בראונשווייג הלמהולץ לחקר זיהומים (HZI) בשיתוף עם Julius-Maximilians-Universität (JMU) של וירצבורג, בו בייזל מחזיק בפרופסורה.
גם פלטפורמת האבחון LEOPARD, שפותחה על ידי המעבדה של בייזל בשיתוף עם JMU ב-2021, ממנפת את CRISPR כטכנולוגיה. ל-LEOPARD יש פוטנציאל לזהות מגוון סמנים ביולוגיים הקשורים למחלה בבדיקה אחת בלבד. הגישה מבוססת על תכנות מחדש של גורמי RNA, מה שנקרא tracrRNAs. RNAs אלה מעורבים באופן טבעי בסיוע לייצר RNAs מובילים המשמשים את Cas9 ונוקלאזות Cas12 שונים.
LEOPARD התמקד ב-Cas9. עם זאת, מערכות CRISPR-Cas כוללות גם קבוצה מגוונת נוספת של נוקלאזות, הנקראת Cas12."
צ'ייס בייזל, ראש המחלקה לביולוגיה סינתטית של RNA במכון הלמהולץ לחקר זיהומים מבוססי RNA (HIRI), וירצבורג
בעוד שגם Cas9 וגם Cas12 חותכים מטרות DNA, Cas12 יכול להגדיל את אות הפלט על ידי ביצוע חיתוכים ב-DNA "בטוחות". זה יכול להפוך את טכנולוגיות הזיהוי לרגישות יותר, ולכן, יעילות יותר.
הצוות בראשות Chase Beisel הרחיב כעת את התכונות הייחודיות של LEOPARD ל-Cas12. החוקרים כינו את השיטה שהתקבלה PUMA (פtracrRNAs הניתנים לשידור Unlock protospacer-סמוך Mזיהוי בלתי תלוי ב-otif של ribonucleic אcids על ידי Cas12 nucleases). פרטי הממצאים שלהם הם נושא למאמר בכתב העת תקשורת טבע.
התגברות על משוכות
למרות שנוקלאזות Cas12 נמצאים בשימוש נרחב באבחון מולקולרי, שתי מגבלות עיקריות נמשכו: טכנולוגיות מבוססות Cas12 הוגבלו למטרות DNA, ורצף זיהוי ספציפי הנקרא PAM, קיצור של מוטיב סמוך ל-protospacerנדרש כדי לזהות את מולקולת המטרה.
PUMA מתמודדת באלגנטיות עם אתגרים אלה. כמו LEOPARD, גם שיטה חדשה זו מסתמכת על tracrRNAs. "באמצעות PUMA, אנו יכולים לתכנת מחדש את ה-tracrRNAs. זה מאפשר לנו להחליט איזה סמן ביולוגי של RNA הופך ל-RNA מנחה. RNA מנחה זה, בתורו, מכוון את Cas12 למולקולת DNA שאנו מספקים ומפעיל את מספרי הגנים", מסביר המחקר הראשון. מחבר, Chunlei Jiao. Chunlei Jiao, לשעבר סטודנט לתואר שני וחוקר פוסט-דוקטורט במעבדת בייזל, היה מעורב גם הוא בפיתוח LEOPARD. לאחרונה החל פרופסור באוניברסיטה הלאומית של סינגפור. "חיתוך DNA אומר לנו איזה סמן ביולוגי היה קיים בדגימה, כמו סמנים ביולוגיים ספציפיים לפתוגנים שונים", מוסיף בייזל.
לכן השיטה החדשה מאפשרת זיהוי של סמנים ביולוגיים של RNA באמצעות נוקלאזות של CRISPR שבדרך כלל יכולים לזהות רק DNA. "זה חשוב במיוחד עבור סמנים ביולוגיים מולקולריים שניתן למצוא רק ברמת ה-RNA. זה כולל נגיפי RNA, למשל", אומר בייזל. ועדיין, PUMA אינו דורש רצף זיהוי ספציפי: ה-PAM כלול במולקולת יעד ה-DNA שסופקה. מכיוון שהחוקרים מספקים את מולקולת המטרה, הם יכולים להציג גם DNA קטוע. כתוצאה מכך, הם הצליחו להגביר משמעותית את מהירות השיטה.
כמה ציפורים, אבן אחת
"ל-PUMA יש פוטנציאל להפוך לכלי גמיש ומדויק לזיהוי RNA", מסכם בייזל. לבסוף, הצוות הדגים את הפוטנציאל של השיטה על ידי זיהוי חמישה פתוגנים חיידקיים הקשורים לאלח דם חריף. הזיהוי שלהם הסתמך על tracrRNA אוניברסלי יחיד, מתוכנת מחדש, המספק אמצעי פשוט להבדיל בין סוגים שונים של חיידקים. זה פותח מגוון רחב של יישומים פוטנציאליים ברפואה: "הטכנולוגיה החדשה מייצגת צורה חדשה של אבחון CRISPR המאפשרת בדיקות מולקולריות אמינות בנקודת הטיפול – בין אם לזיהוי פתוגנים ויראליים או חיידקיים או זיהוי של סמנים ביולוגיים של סרטן ", אומר ג'יאו.
צוות המחקר כבר מתכנן את הצעדים הבאים שלו: "המטרה שלנו היא להשיג קריאה מרובה דומה לזה של LEOPARD ולהרחיב את מגוון היישומים של הטכנולוגיה", אומר בייזל, שגם צופה שימוש נרחב בקהילת המחקר: " אנו מקווים שהמחקר שלנו ידרבן חקירה נוספת של תכנות מחדש של tracrRNA."
