למד כיצד מומחים מקדמים ניתוח וגילוי בנזודיאזפין באמצעות תובנות מהמעבדה.
איך ניגשת לפיתוח שיטות לניתוח מקיף של בנזודיאזפין?
אמילי לי: פיתחנו שיטת UPLC-MS/MS מהירה באמצעות לוחיות μX μX μLOUTE של OASIS עבור SPE במצב מעורב מפושט. הוא כולל 26 תרכובות – בנזוס מסורתיים ומעצבים – ומשיג הפרדת בסיס תוך פחות מארבע דקות. השתמשנו בסטנדרטים פנימיים יציבים עם תווית איזוטופית בכל מקום אפשרי ותוקף להתאוששות חזקה ועקביות מטריקס על פני שישה מגרשי שתן.
בוריס לזרוב: התמקדנו בזרימת עבודה פרגמטית המתאימה לדם לאחר המוות. השיטה שלנו השתמשה במשקעים חלבוניים ואחריה דילול אוטומטי בהדגמה האוטומטית. כיוונו 12 אנליטים, כולל בנזוס מסורתיים ורומניים כמו ברוטיזולם ונגזרות פלואוריות. השיטה קיבלה תוקף לטווח דינאמי רחב ורגישות ברמה נמוכה (עד 1 ng/ml עבור NPs Benzos).
קרדיט תמונה: סטודיו ג'ורג 'מרטין/Shutterstock.com
איך אתה בוחר באיזה מעצב בנזוס לכלול בפאנל שלך?
אמילי לי: בדקנו בספרות כדי לתעדף תרכובות שדווחו לעיתים קרובות או מעוררים דאגה הולכת וגוברת. זה איזון – המטרה שלנו הייתה לכסות טווח רחב ומייצג מבלי להיות מורכב מדי.
בוריס לזרוב: בחרנו תרכובות על סמך מה שאנו מגלה בפועל במסכים השגרתיים שלנו. עבורנו, ברוטיזולם הפך להיות די נפוץ, ולכן היה הגיוני לתעדף את זה. גם מעשי עניינים, התמקדנו במה שיש לנו הרלוונטיות הקלינית ביותר או משפטית ביותר.
אם מעבדה רוצה להוסיף מעצב חדש בנזו, איך היית ממליץ להם לעשות את זה?
אמילי לי: אם יש לך את הסטנדרט, התחל על ידי החדרתו כדי לייעל את תנאי ה- MS. ואז הפעל אותו בנפרד כדי לקבוע את זמן השמירה. אם זה מתאים היטב עם השיפוע הקיים ומראה התאוששות מיצוי טובה, פשוט קפל אותה לשיטה.
בוריס לזרוב: הייתי אומר שלא להמציא את הגלגל מחדש – בדוק אותו תחילה בשיטה הנוכחית שלך. אם זה עובד, נהדר. אם לא, שקול להריץ אותו בנפרד או ליצור לוח קטן ספציפי ל- NPS.
איזה סוג של התאוששות והשפעות מטריצות צפית?
אמילי לי: ההתאוששות הממוצעת בין 26 אנליטים הייתה 86 %, כאשר CVS מתחת ל -10 %. לרוב התרכובות היו דיכוי יונים, אך הערכים היו עקביים על פני מגרשי מטריקס. כמה אנליטים ללא סטנדרטים פנימיים שכותרתו (כמו Etizolam) הראו שונות רבה יותר – משהו שכדאי לזכור במהלך האימות.
בוריס לזרוב: לשיטת המשקעים החלבונית שלנו היו התאוששות בטווח של 50-77 %, עם דיכוי יונים במיוחד עבור תרכובות כמו כלורדיאזפוקסיד. עם זאת, מכיוון שחילצנו את עקומת הכיול המלאה וראינו רגישות טובה בקצה הנמוך, היא עדיין הייתה יעילה לצרכים שלנו.
מה עם יציבות אנליטים, במיוחד עבור בנזוס המעצב?
בוריס לזרוב: זה היה אתגר גדול. המעצב בנזוס היה פחות יציב מאשר אלה המסורתיים. לדוגמה, בנזוס פלואוריים לעתים קרובות משפילים לאחר יום אחד בלבד ב –20 מעלות צלזיוס. גילינו ששלושה ימים היו הגבול העליון עבור מרבית בנזוס ה- NPs.
אמילי לי: לא עשינו מחקרי יציבות מלאים, אך לא ראינו השפלה משמעותית במשך כמה ימים עבור תמציות שתן. עם זאת, אנו ממליצים על מעבדות להעריך יציבות בתנאים הספציפיים שלהן, במיוחד אם יש צורך בהזרקה מחודשת.
כמה זמן מכין מדגם לוקח בשיטת SPE שלך?
אמילי לי: בעזרת פיפטה ידנית והכנה רב-ערוצית, לקח בערך 1-1.5 שעות להכנת 20 דגימות, כולל הידרוליזה. אוטומציה תפחית זאת באופן משמעותי. מכיוון שכל העיבוד מתרחש בצלחת 96 בארות, הוא ניתן להרחבה בקלות.
האם חקרת סוגי עמודות אחרים מעבר ל- C18?
אמילי לי: לא – אנו דבקנו עם טור C18 מסורתי, שעבד היטב להפרדה. זה סוג של מעבר לטוקסיקולוגיה.
בוריס לזרוב: אותו דבר כאן. בנזוס הידרופובי מספיק כדי ש- C18 יעיל. לא ראינו צורך לחקור שלבים נייחים אלטרנטיביים ליישום זה.
האם הייתם מאמצים טכניקת הכנה מדגם שונה לתפוקה גבוהה יותר או מטריצות מורכבות?
בוריס לזרוב: השיטה הנוכחית שלנו היא משקעים חלבונים, וזה נהדר למהירות אך מציג יותר אפקטים של מטריקס. אם יש צורך בניקיון גבוה יותר – למשל באישור קליני – אתה יכול לעבור ל- SPE או SLE. אבל ברוב הדגימות שלאחר המוות שלנו, הסחר היה שווה את זה.
האם השיטות שלך היו תואמות אוטומציה?
אמילי לי: כן, זרימת העבודה של SPE תוכננה תוך התחשבות באוטומציה. אתה יכול לשלב את זה בפלטפורמות קיימות מכיוון שכל השלבים נעשים בבר-טוב-הידרוליזה, חמצה וחילוף.
בוריס לזרוב: השתמשנו באוטומציה בהדגמה האוטומטית עצמה – להפחתת חוזק הממס והזרקתו. זה עוזר להפחית את השונות ומפשט את זרימת העבודה הכוללת.
האם יש תוכניות עתידיות ליישם שיטות אלה על מטריצות אחרות, כמו שיער או נוזל דרך הפה?
אמילי לי: עדיין לא יישמנו שיטה זו על שיער, אך ווטרס עובדת כעת על לוח מקיף יותר של התרופות לשיער. זה עשוי לכלול את בנזוס וצריך להיות זמין בקרוב.
בוריס לזרוב: לא כרגע במעבדה שלנו. אנו ממוקדים בדם שלאחר המוות ומטריצות קליניות כמו שתן או סרום. אבל עם שינויים קלים, אני חושב שזה ניתן להתאמה.
צפו בסמינר המקוון לפי דרישה
על תאגיד ווטרס
מאז שנת 1958, Waters Corporation עוסקת בעסק של מכשירים אנליטיים חדשניים המסייעים למדענים להגיע ליעדים המדעיים שלהם, להגדיל את הפרודוקטיביות ולהרוויח ארגונים מבוססי מעבדה תשואה גבוהה יותר על השקעותיהם במחקר, פיתוח ובקרת איכות.
בין אם בעבודה לגלות תרופות חדשות, ממציא דרכים חדשות ויעילות יותר לטיפול במחלות, להבטיח את הבטיחות באספקת המזון ושתייה של עולם, מעקב ושליטה בזיהום, או שמירת אוצרות האמנות הגדולות בעולם, מדענים ברחבי העולם מסתמכים על מוצרי כרומטוגרפיה נוזלית של מים ומוצרי ספקטרומטריה המונית.
50+ שנה בעסקים, ווטרס היא כיום אחת החברות הגדולות בתעשיית המכשירים האנליטיים, ותומכת במדענים העובדים אלפי מעבדות ברחבי העולם. עם מוניטין קשה שהרוויח למומחיות יישומים, מסירות להצלחת הלקוחות ותמיכה שלאחר המכירה, ווטרס בולטת בקרב בני גילו, ושנה אחר שנה היא אחת החברות הטובות ביותר בענף.
