בסקירה שפורסמה לאחרונה בכתב העת PNASחוקרים חוקרים שיטות מסירה לא-ויראליות וספציפיות לתא, מקבצים קבועים ברווחים קצרים פלינדרוםיים קצרים (CRISPR)–CRISPR הקשורים לחלבונים (Cas) ומדגישים את היתרונות שלהם עבור יישומי מחקר וריפוי גנטי.
לימוד: מסירה לא ויראלית ממוקדת של עורכי גנום in vivo. קרדיט תמונה: Catalin Rusnac / Shutterstock.com
שיפור האספקה של אנזימי CRISPR-Cas
אנזימים CRISPR-Cas מציעים דיוק וקלות בעריכת הגנום; עם זאת, הם קשורים גם לחששות בטיחותיים מסוימים על הפוטנציאל שלהם לגרום לשינויים קבועים. הספציפיות המשופרת של Cas9 מסמנת התקדמות, אך אספקה ממוקדת נותרה חיונית למזעור סיכונים.
וקטורים ויראליים נחקרו בהרחבה ככלי מסירה של אנזימים אלה. עם זאת, מערכות אלו קשורות גם לסיכונים של אימונוגניות ושיבושים גנטיים.
חלופות מתפתחות כמו CRISPR-Cas ribonucleoproteins (RNPs) ונוקלאזות מקודדות של חומצה ריבונוקלאית שליח (mRNA) מפחיתות השפעות מחוץ למטרה וסיכוני אונקוגנזה אך חסרות מיקוד ספציפי. לדוגמה, Cas9 RNPs, המציעים נוכחות תאית חולפת וחסכוניות, מפחיתים השפעות מחוץ למטרה ואימוגניות; עם זאת, האספקה הממוקדת שלהם מהווה אתגר משמעותי. לפיכך, נותר צורך דחוף באסטרטגיות מסירה מתקדמות.
מחקר נוסף חיוני לפיתוח מנגנוני מסירה בטוחים ומדויקים יותר עבור מערכות CRISPR-Cas, שיבטיחו עריכת גנום ממוקדת עם השפעות מינימליות מחוץ למטרה וסיכונים קליניים נמוכים יותר.
Ex vivo שיטות מסירה ממוקדות
ניתן להשיג משלוח ממוקד באמצעות בידוד פיזי של תאים עבור ex vivo עריכת גנום. שיטה זו יעילה במיוחד עם תאים hematopoietic, אשר ניתן לבודד בקלות ולערוך מחוץ לגוף.
טכניקות כמו אלקטרופורציה אפשרו עריכת גנום יעילה בתאי T, כמו גם תאי גזע ואב המטופואיטים (HSPCs), ובכך מציעות פוטנציאל ייחודי לחולל מהפכה בטיפול במחלות המטולוגיות כמו מחלת תאי חרמש (SCD) ובטא-תלסמיה. למרות יעילותו, מגבלה חשובה של אלקטרופורציה היא תחולתו המוגבלת על רקמות אחרות, כמו גם השפעות ציטוטוקסיות פוטנציאליות.
Ex vivo עריכת הגנום קידמה גם את הרפואה התחדשותית. לדוגמה, תאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSCs) המושרים עם Cas9 RNPs שימשו לפיתוח טיפולים להפרעות עור גנטיות ולסוכרת מסוג 1 (T1D), ובכך להדגים את הפוטנציאל של שיטה זו להחליף או לחדש רקמות פגועות. ספציפיות זו מבטיחה סיכון מינימלי לעריכת סוגי תאים לא מכוונים ומספקת סביבה מבוקרת להתערבויות טיפוליות.
In vivo עריכת גנום: אתגרים והזדמנויות
In vivo עריכת הגנום מוגבלת ביכולתה למקד במדויק רקמות ספציפיות ללא היתרון של בידוד. טכניקות כמו הזרקה ישירה השיגו הצלחה מקומית במוח, בעור ובגידולים, בעוד שחידושים כמו פפטידים חודרים לתאים וננו-חלקיקי שומנים (LNPs) מציעים אפשרויות אספקה רחבות יותר. התקדמות אלו יתמכו בהכרח בפיתוח מערכות CRISPR-Cas עתידיות שניתן לספק באופן מערכתי עם דיוק ספציפי לתא.
התקדמות במשלוח: LNPs ורכבי משלוח מעטפים (EDVs)
LNPs מאפשרים מסירה מערכתית ובריחה אנדוזומלית לשחרור כלי עריכת גנום ישירות לתאים. אריזה של רצפים גנטיים גדולים יותר ומכוונת לרקמות ספציפיות, LNPs כבר נחקרו על הפוטנציאל שלהם לטפל במחלות מורכבות כמו היפרכולסטרולמיה משפחתית.
כלי רכב בהשראה ביולוגית כולל חלקיקים דמויי וירוסים (VLPs) ושלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) מחקים מנגנוני מסירה ויראליים לעריכה ממוקדת. EDVs אלה ממנפים תהליכים טבעיים לעריכת גנום יעילה, ובכך מדגימים את הנוף המתפתח של שיטות אספקת CRISPR-Cas ואת הפוטנציאל שלהן להתגבר על המגבלות הנוכחיות.
Ex vivo דיוק עם VLPs
VLPs הראו הבטחה באספקה מדויקת של כלי עריכת גנום לסוגי תאים ספציפיים ב- ex vivo הגדרה. חלקיקים מהונדסים אלה משתמשים לרוב בגליקופרוטאין VSV-G בשל טווח הקולטנים הרחב שלו, כולל קולטן ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL-R), כדי להקל על כניסה למגוון רחב של תאים אנושיים, כגון תאי T, תאי B. , iPSCs ואשכול של דיפרנציאציה (CD)34+ HSPCs.
ישימות רחבה זו משוכללת עוד יותר על ידי פסאודוטייפ VLPs עם גליקופרוטאין ויראלי אחרים כדי בסופו של דבר למקד תאים על בסיס אינטראקציות קולטן ספציפיות. לדוגמה, מינוף הגליקופרוטאין של מעטפת נגיף הכשל החיסוני האנושי מסוג 1 (HIV-1) מכוון VLPs לתאי CD4+ T, ובכך משפר את הספציפיות של המסירה וממזער את ההשפעות מחוץ ליעד. גישה זו סייעה בתכנות מחדש של תאי מערכת החיסון לטיפול בסרטן ועריכת תאי גזע לרפואה רגנרטיבית.
In vivo מתקדם עם EDVs
גם VLPs וגם EVs מציעים פלטפורמה לאספקה ישירה ומקומית של עורכי CRISPR-Cas9. EDVs אלו עוקפים את הצורך במיקוד ספציפי לתא כאשר הם ניתנים ישירות לאתר המעניין, כגון העין או רקמת השריר, ובכך מספקים הזדמנות לטפל במצבים כמו ניוון שרירים דושן (DMD) ומחלות ניווניות. יתר על כן, מתן מערכתי של VLPs השיג עריכת כבד ממוקדת כדי בסופו של דבר לטפל בהפרעות הקשורות לכבד.
הספציפיות של מערכות אלו מוגברת על ידי הצגת מולקולות מיקוד על משטח ה-VLP, המפנה את מכונות עריכת הגנום לתאים או איברים ספציפיים עם פעילות מינימלית מחוץ למטרה.
כיוונים עתידיים
הפוטנציאל המלא של טיפולי CRISPR-Cas, במיוחד עבור מחלות שאינן כבדיות ולא המטולוגיות, מסתמך על פיתוח של כלי לידה מתוחכמים יותר. האתגר טמון בהשגת ספציפיות מסוג תא in vivo מבלי לגרום לתגובות חיסוניות או השפעות מחוץ למטרה.
חידושים אחרונים בניסוח LNP וחקירה של EDVs בהשראה ביולוגית מציגים אסטרטגיות מבטיחות להקלה על דיוק המסירה. התקדמות אלו, בשילוב עם סקר בתפוקה גבוהה והנדסת נוגדנים, יובילו ככל הנראה לפיתוח של טיפולי CRISPR-Cas זעיר פולשניים וספציפיים ביותר.
