המחקר מפענח את לחיצת היד המולקולרית בין קולטני LDL ל-apoB100, ושופך אור על חילוף החומרים של הכולסטרול ותפקידו במחלות לב וכלי דם.
מחקר: מבנה של אפוליפופרוטאין B100 הקשור לקולטן ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה. קרדיט תמונה: Nemes Laszlo / Shutterstock
במחקר שפורסם לאחרונה בכתב העת טֶבַעהחוקרים הבהירו את הבסיס המבני של אינטראקציה של אפוליפופרוטאין B100 (apoB100) עם קולטן ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDLR) והשלכותיו על היווצרות דימר ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL) והיפרכולסטרולמיה משפחתית (FH).
רֶקַע
ל-LDL תפקיד קריטי במחלות לב וכלי דם, הגורם העולמי המוביל לתחלואה ולתמותה. הוא מעביר כולסטרול, כאשר רוב הפינוי מתווך על ידי LDLRs על הפטוציטים. שיבושים בתפקוד LDLR או מוטציות apoB100, כפי שניתן לראות ב-FH, מובילים להצטברות כולסטרול ליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה (LDL-C), מה שמעורר טרשת עורקים. מעכבי 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A (סטטינים), הטיפול הראשוני, מורידים את ה-LDL-C על ידי הגברת ביטוי LDLR, אולם מוטציות רבות הקשורות ל-FH חסרות הבנה מכניסטית. חגורת ה-apoB100 β, מבנה אמפיפתי מתמשך המקיף את ליבת השומנים של LDL, ממלאת תפקיד מרכזי בקשירה ל-LDLR אך היא מאתגרת ללימוד בשל הקיפול תלוי השומנים וגודלה הגדול. דרוש מחקר נוסף כדי לפענח מנגנונים אלו ולשפר את המניעה והטיפול במחלות לב וכלי דם.
על המחקר
המחקר הנוכחי השתמש בטכניקות מתקדמות של קריו-אלקטרון מיקרוסקופיה (cryo-EM) כדי להבהיר את האינטראקציות בין apoB100, LDL ו-LDLR. חלקיקי ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה טוהרו מפלסמה אנושית, בודדו באמצעות אולטרה-צנטריפוגה רציפה, ואופיינו להדמיית קריו-EM אופטימלית. התחום החוץ-תאי של ה-LDLR, המכיל מוטציה נקודתית אחת להגברת היציבות, התבטא באופן רקומביננטי בתאי כליה עובריים 293T (HEK293T) אנושיים. פיגום ננו-בודי-לגובודי בעל זיקה גבוהה הופעל גם כדי לייצב את apoB100 ולהקל על יישור החלקיקים במהלך ההדמיה.
איסוף נתונים של Cryo-EM כלל ניתוח של חלקיקים בודדים כדי לקבוע את המאפיינים המבניים של LDL, apoB100 והקומפלקסים שלהם עם ה-LDLR. טכניקות חידוד איטרטיביות שיפרו את הרזולוציה, ואיפשרו מידול מפורט של חגורת ה-apoB100 β וממשקי הקישור הכפולים שלה עם ה-LDLR. ניסויים צולבים אימתו את הממצאים הללו, והבטיחו את השלמות המבנית של המודלים.
המחקר השיג שחזורים ברזולוציה גבוהה של קומפלקסים של apoB100-LDLR באמצעות שיטות אלו, וחשף ממשקי קישור כפולים קריטיים לדימריזציה של ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה ומחזור LDLR.
תוצאות המחקר
ה-LDLR, חלבון טרנסממברני מסוג 1 וחבר במשפחת העל LDLR, מתווך את הדימריזציה של LDL. התחום החוץ-תאי שלו מורכב משבעה מודולי LDLR מסוג A (LA1-LA7), שלושה מודולים דמויי גורם גדילה אפידרמיס (EGF), תחום מדחף β ואזור עם סוכר מסוג O. האזור החוץ-תאי LDLR (שאריות 22-788) התבטא באופן רקומביננטי ומטוהר לצורך מחקרים מבניים, בעוד ש-LDL בודד מפלסמה אנושית באמצעות אולטרה-צנטריפוגה ציפה. המחקר אישר ש-LDLR קושר ל-LDL בזיקה גבוהה, עם קבועי דיסוציאציה שנעים בין 1.2 ל-2.2 ננומטר.
באמצעות cryo-EM, LDLR נצפה כמונומר בבידוד אך אוליגומריזציה לקומפלקסים מסדר גבוה יותר כאשר נקשר ל-LDL. קומפלקסים אלה חשפו כי LDLR מתווך דימריזציה של LDL באמצעות אינטראקציות בשני אתרי קישור נפרדים על apoB100, החלבון המבני העיקרי של LDL. אתר קישור אחד כולל מודולי LDLR LA3 עד LA7 ו-EGF-A העוסקים באזור חגורת β ב-apoB100, בעוד שהשני נוצר על ידי תחום ה-β-פרופלר של LDLR מקשר לתחום ה-N-טרמינלי של apoB100.
ניתוחים מבניים נוספים של קומפלקס LDL-LDLR הראו שחלקיקי LDL דימריים מחוברים על ידי שתי מולקולות LDLR בתצורה של 2:2:2 (LDL:LDLR:legobody). הסדר זה מאפשר אנדוציטוזיס יעיל בתיווך קולטן. חידודים מקומיים של נתוני cryo-EM זיהו את חגורת ה-apoB100 β כמבנה אמפיפתי מתמשך עטוף סביב ליבת השומנים של LDL. חגורת ה-β מורכבת מחמישה לוחות המחוברים באמצעות לולאות, כאשר אזורי מפתח תורמים לקשירת LDLR. מאפיינים מבניים אלה מתיישבים עם מבחני תפקוד ומספקים תובנה לגבי הדינמיקה של חילוף החומרים של LDL.
מוטציות FH מופו לממשק הקישור LDLR-apoB100, מה שהבהיר את השפעתן על פינוי LDL. מוטציות כגון R3059C, K3394N ו-R3527Q, הממוקמות בחגורת ה-apoB100 β, הפחיתו משמעותית את הקישור והספיגה של LDL. ממצאים אלה מאשרים את ההפרעה המכניסטית הנגרמת על ידי מוטציות FH, תוך הדגשת הבסיס המבני של תפקוד LDLR פגום. המחקר מדגיש את התפקיד הקריטי של LDLR בדימריזציה של LDL ובספיגה תאית, ומציע תובנות מבניות לגבי מחזוריות קולטנים ופתוגנזה של היפרכולסטרולמיה.
מסקנות
על ידי זיהוי שני ממשקי קישור נפרדים, הממצאים אימתו את המנגנונים העומדים בבסיס דימריזציה של LDL, מחזוריות קולטן והשפעת מוטציות FH. תובנות מבניות אלו מדגישות כיצד שיבושים באינטראקציות apoB100-LDLR תורמות לרמות גבוהות של LDL-C ולמחלות לב וכלי דם. הגילוי של אתרי הקשירה הכפולים הללו מספק מסגרת מכניסטית לטיפולים ממוקדים שמטרתם לשפר את פינוי ה-LDL ולהפחית סיבוכים הקשורים להיפר-כולסטרולמיה.