פלטפורמה טכנולוגית יוצרת רקמות עצביות תלת מימדיות שבהן מתחברים נוירונים וגליה

במחקר שפורסם לאחרונה ב תא גזע של תאחוקרים ייצרו רקמות מוח אנושיות מודפסות בתלת מימד (3D), המאפשרות יצירת רשתות עצביות מתפקדות שיכולות לדמות פעילות רשת במצבים נורמליים ופתולוגיים.

רקע כללי

הבנת רשתות עצבים במוח האנושי היא קריטית להבנת בריאות המוח ומחלות. עם זאת, מודלים מבוססי בעלי חיים אינם יכולים לשחזר ביעילות את עיבוד הנתונים בסדר גבוה של המוח האנושי עקב שינויים בהרכב התא, רשתות עצביות ואינטגרציה סינפטית. הדפסה ביולוגית תלת מימדית מספקת שיטה מדויקת יותר ליצירת רקמות מוח אנושיות על ידי מיקום פיזי של הידרוג'לים ותאים חיים בתוך ציטוארכיטקטורה מסובכת מבחינה פיזיולוגית. עם זאת, הדפסה ביולוגית של רקמות רכות, כגון המוח, מעוררת דאגה מכיוון שחומרים ביולוגיים רכים אינם יכולים לקיים ארכיטקטורות תלת מימד מורכבות או ג'לים קשיחים.

לגבי המחקר

במחקר הנוכחי, החוקרים פיתחו פלטפורמת הדפסה ביולוגית תלת מימדית לייצור רקמות עם סוגי תאי מוח אנושיים מוגדרים בכל מימד רצוי.

הצוות שאף לבנות רקמות עצביות שכבות, כולל תאי אבות עצביים (NPCs) היוצרים חיבורים בתוך ובין שכבות המוח, תוך שמירה על המבנה שלם. הם יצרו ביו-דיו להדפסה. הם השתמשו בג'ל פיברין כדי להדפיס את הרקמות. שיטות להדפסה ביולוגית כוללות טכניקות מבוססות אקסטרוזיה, לייזר ושיטות מבוססות טיפות. טכניקת ההדפסה הביולוגית התלת-ממדית בשיחול הפקידה ג'ל בשכבות כדי לדמות מבני מוח כגון למינציה של קליפת המוח האנושית.

החוקרים בחרו עובי של 50 מ"מ לכל שכבה ובנו רקמות רב-שכבתיות על ידי הנחת השכבות בסידור אופקי צמודות זו לזו. הם תכננו רקמות מוח מודפסות בתלת מימד להיות דקות יחסית אך פונקציונליות ורב-שכבתיות, עם הרכבי תאים מבוססים וממדים רצויים, ומתוחזקות ונבדקות בקלות בתנאי מעבדה סטנדרטיים.

החוקרים קבעו כי 2.50 מ"ג לכל מ"ל פיברינוגן ו-0.50 עד 1.0 U של תרומבין היו ריכוזים אופטימליים ליצירת הידרוג'ל, וכתוצאה מכך משך ג'ל של 145 שניות, מה שאיפשר הדפסת צלחת עם 24 בארות. לאחר שש שעות, רוב (85%) התאים היו קיימא ושרדו במשך שבעה ימים. הצוות יצר את ההבלטה המדיאלית (MGE) שמקורה בחומצה גמא-אמינו-בוטירית (GABA) ואבות קורטיקליים (גלוטמט) ממבטא חלבון ניאון ירוק (GFP⁺) ו-GFP^– תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) כדי לחקור האם GABAergic interneuron ונוירונים גלוטמטריים יוצרים קשרים סינפטיים כאשר הם מוכנסים לרקמות מודפסות. לפני ההדפסה, הם שילבו את שתי אוכלוסיות האבות ביחס של 1:4 כדי להתאים את היחס בין נוירונים פנימיים לנוירוני הקרנה קורטיקליים בקליפת המוח.

החוקרים תיעדו נתונים אלקטרו-פיזיולוגיים מרקמות שהודפסו עם אבות קליפת המוח גלוטמטרגיים GFP+, אבות MGE GABAergic לא צבעוניים, ואבות אסטרוציטים שמקורם ב-hPSC המשולבים בתאי עצב גלוטמט ובאינטרנוירונים של GABA. הרקמה המודפסת צוימנה עם סמן אקסונלי, SMI312. הם חקרו את מחלת אלכסנדר (AxD), מחלה נוירודגנרטיבית הנגרמת על ידי חריגות בגן GFAP, כדי לחקור מנגנונים פתוגניים. הם השתמשו בהדמיה חיה של ספיגת גלוטמט על ידי כתבים פלורסנטים רגישים לגלוטמט (iGluSnFR) כדי לחקור אינטראקציות נוירון-אסטרוציטים וחיבורי נוירון-גליה ב-AxD.

תוצאות

האבות העצביות המודפסות התפתחו לנוירונים תוך שבועות, ויצרו רשתות עצביות פונקציונליות בתוך ועל פני שכבות הרקמה. אבות אסטרוציטים מודפסים הבשילו לאסטרוציטים בעלי תהליכים מורכבים לתפקוד ברשתות נוירונים-אסטרוציטים. טכניקות תרבות קונבנציונליות יכולות לשמר את רקמות המוח התלת-ממדיות, מה שמקל עליהן לחקור אותן במסגרות פיזיולוגיות ופתולוגיות. כדאיות התא ירדה עם עליית ריכוזי תרומבין בריכוזי פיברינוגן של 2.50 מ"ג/מ"ל, אך נותרה ללא שינוי בריכוז קבוע של 0.50 U פיברינוגן, ותאים נצברו ברמות פיברינוגן מוגברות.

התאים העצביים שהודפסו ביולוגית התבגרו ושמרו על צורת רקמה, כאשר תאים המבטאים GFP ברצועה אחת הופכים לנוירונים של חלבון 2 (MAP2+) הקשורים למיקרו-צינוריות שבוע לאחר ההדפסה. הרקמה המודפסת שמרה על תצורה יציבה שבה אבות עצביים התרבו ובנו רשתות עצביות. תת-הסוגים הנוירונים הקימו רשתות פונקציונליות בתוך הרקמות המודפסות ביולוגיות, עם תאי MGE שמקורם ב-hPSC המבטאים NK2 homeobox 1 (NKX2.1) ו-GABA ואבות קליפת המוח חיוביים ל-Forkhead-box G1 (FOXG1) ולקופסה מזווגת 6 (PAX6). קונסטרוקציות רקמות עצביות המודפסות ביולוגיות מעודדות את הצמיחה של נוירונים גלוטמטרגיים בקליפת המוח ואינטרנוירונים GABAergic.

החוקרים השתמשו בתמיסת אשלגן כלוריד בריכוז גבוה כדי להדפיס רקמות המכילות נוירונים ואסטרוציטים, והדגימו קשרים פונקציונליים. האסטרוציטים ביטאו טרנספורטר גלוטמט 1 (GLT-1), המעיד על התבגרות. רצועות הנוירונים המודפסות של קליפת המוח והסטריאטליות נותרו ללא פגע 15 ימים לאחר ההדפסה, ועצבי GFP ו-mCherry התפתחו זה כלפי זה. רקמות המוח האנושי המודפסות עשויות לשכפל תהליכים חולים, כאשר אסטרוציטים של AxD מציגים צבירת GFAP תוך תאית. לאחר 30 יום, נוירונים MAP2+ ואסטרוציטים GFAP+ הציגו מורפולוגיה מורכבת וביטוי סינפסין.

סיכום

בסך הכל, ממצאי המחקר הדגימו את היכולת של הדפסת תלת מימד ליצור רקמות מוח מתפקדות להדמיית פעילות רשת במסגרות נורמליות ופתולוגיות. הרקמות שנוצרו ביו-דיו מייצרות קשרים סינפטיים פונקציונליים בין תת-סוגים עצביים ורשתות נוירונים-אסטרוציטים תוך שבועיים עד חמישה שבועות. פלטפורמת התלת מימד מספקת סביבה מוגדרת לחקר רשתות מוח אנושיות במסגרות בריאות ופתולוגיות; עם זאת, יש לו מגבלות, כגון הרכות של הג'ל ועובי 50 מ"מ של הרקמות המודפסות.