עריכת פריים חד פעמית מכוונת לגורם גנטי שכיח לסיסטיק פיברוזיס

במחקר שפורסם לאחרונה ב- טבע הנדסה ביו-רפואיתקבוצת חוקרים אופטימיזה עריכה ראשונית (PE) לתיקון יעיל של מווסת ההולכה הטרנסממברנית (CFTR) F508del (מחיקת שלושה נוקלאוטידים שהיא הגורם העיקרי למוטציה של CF) בתאי אפיתל בדרכי הנשימה האנושיות, השגת יעילות תיקון גבוהה ושיקום תפקודי עם השפעות מינימליות מחוץ למטרה.

רקע כללי

PE מאפשר עריכת גנום מדויקת ללא צורך בכפול גדילים חומצה דאוקסיריבונוקלאית (DNA) שבירה, מפחיתה את הסיכון של עוברי אורח ועריכה מחוץ ליעד. בניגוד לשיטות המתווכות בנוקלאז, PE ממזער אינדלים לא מבוקרים, מחיקות גדולות, הפעלת p53, החדרת רטרוטרנספוזון ופגמים כרומוזומליים. הוא אינו דורש תבניות DNA של תורם והוא יעיל בתאים מיטוטיים ולא מיטוטיים כאחד, עם יישומים מוצלחים in vivo בעכברים ובפרימטים שאינם אנושיים.

על ידי שילוב של ניקאז הניתן לתכנות, תמלול הפוך ומדריך PE חומצה ריבונוקלאית (RNA), PE מתקן ביעילות מוטציות פתוגניות. דרוש מחקר נוסף כדי לשפר את היעילות, הישימות והבטיחות שלו במסגרות קליניות.

לגבי המחקר

פלסמידים לביטוי RNA Guide, כולל RNAs Prime Editing Guide (pegRNAs), Engineered (e)pegRNAs, Nicking Guide (ng) RNAs, Dead Single Guide (dsg) RNAs ו-Single Guide (sg) RNAs, שובטו וטיהרו באמצעות ערכות סטנדרטיות . הגברה של תגובת שרשרת פולימראז של DNA (PCR) בשימוש Phusion U Green Multiplex PCR מיקס מאסטר. ל-PegRNA ו-epegRNA סינתטיים היו שינויים ספציפיים והם הגיעו מ-Agilent Research Labs, Synthego וטכנולוגיות DNA משולבות.

עורך ראשי ושליח (m)RNA קשורים נוצרו באמצעות שעתוק במבחנה וטיהרו. תאי Human Embryonic Kidney 293T Cells (HEK293T) מ-American Type Culture Collection תורבו במדיום שונה של Eagle, בעוד תאים 16HBEge-F508del (Immortalized Human Bronchial Epithelial Cells Homozygous for CFTR F508del Mutation) ממדיום Cystic Fibrosis Essential. תאי אפיתל ראשוניים בדרכי הנשימה בודדו מתורמים, הורחבו והתמיינו במדיום PneumaCult Air-Liquid Interface Medium (PneumaCult-ALI).

תאי HEK293T הועברו באמצעות Lipofectamine 2000 עם כמויות פלסמיד ספציפיות והודגרו במשך 72 שעות. 16HBEge-F508del ותאי אפיתל דרכי הנשימה הראשוניים עברו אלקטרופורציה עם ריאגנטים PE RNA ותורבבו. DNA גנומי הופץ באמצעות פרוטוקולי תמוגה מותאמים אישית, ומיון תאים מופעל עם פלואורסצנטי הכין תאים למיון.

רצף High-Throughput Sequencing (HTS) של לוקוסים גנומיים כלל שני סבבים של PCR עם פריימרים עם ברקוד של Illumina, ו-CRISPResso2 שימש לניתוח יעילות עריכה ואינדלים. קו תאים הומוזיגוטי CFTR F508del HEK293T נוצר באמצעות טרנספקציה של אסטרטגיית PE2 ודילול מגביל.

רצפי pegRNA תוכננו באמצעות DeepPrime ו-Prime Editing Rational Design and Implementation Computational Tool גרסה 2.0 (PRIDICT 2.0), מסונתזים ונבדקו. באמצעות מבחני תא העריכו את פעילות ערוץ CFTR. מועמדות לאתר מחוץ ליעד בוצעה עם Circularization עבור In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing (CIRCLE-seq), ואתרים מובילים נותחו עבור אינדלים והחלפות באמצעות HTS.

תוצאות המחקר

הצוות ביקש לתקן את המוטציה CFTR F508del זמן קצר לאחר דיווח על PE במקור בשנת 2019. הם יצרו לראשונה שורת תאים משובטית HEK293T הומוזיגוטית למחיקה זו בגן CFTR האנדוגני. באמצעות קו תאים זה, הם סקרו pegRNAs עם אורכי Primer Binding Site (PBS) ו-Reverse Transcription Template (RTT) שונים בשני פרוטו-ספייסרים F508del-proximal (NGG1 ו-NGG2). הם לא הבחינו בתיקון עם NGG1 pegRNAs, ככל הנראה בשל רצף TTTT שפועל כמסיים שעתוק. תיקון זוהה עם NGG2 pegRNAs, אך יעילות העריכה לא עלתה על 0.2%.

כדי לשפר את התיקון, בוצע מסך PE3 של שני NGG2 pegRNAs נגד פרוטו-ספייסרים שונים של ngRNA. בעוד שה-PE3 NGG2 pegRNA הטוב ביותר הראה שיפור לעומת PE2, ממוצע העריכה המקסימלי לא עלה על 0.5%. ההשערה הייתה שתיקון לא יעיל עשוי לנבוע ממצב כרומטין המשפיע על הנגישות של אתר העריכה ל-Cas effectors. עריכת A•T-to-G•C יעילה באמצעות עורך בסיס אדנין (ABE) אישרה ש-NGG1 ו-NGG2 היו נגישים על ידי משפיענים של Cas מונחי pegRNA.

פותחו מספר התקדמות ב-PE, כולל epegRNAs עם מוטיבים של RNA pseudoknot להגנה מפני פירוק אקסונוקלאז, עיכוב של תיקון אי-התאמה של DNA (MMR) באמצעות MLH1dn וחלבון PEmax prime editor. חבילת PE6, הכוללת RTs שפותחו במעבדה ודומיינים של עורך ראשי Cas9, הוצגה גם כן.

בשילוב השיפורים הללו, הצוות סקר 178 epegRNAs עם אורכי PBS ו-RTT שונים על פני שבעה פרוטו-ספייסרים, כולל NGG ו-Protospacer Adjacent Motifs המוכרים על ידי וריאנט Cas9 שונה (NGA PAMs). הייעוד הספציפי של RNA מדריך עריכה ראשי עם אורך אתר קשירת פריימר של 13 ואורך תבנית תעתיק הפוך של 41 (NGG2 PBS13 RTT41) הראה שיפור משמעותי בשיעורי העריכה.

פיתוח נוסף כלל בדיקת ngRNA מניסויי PE3 המוקדמים יותר עם epegRNA NGG2 PBS13 RTT41 בניסוי PE5max. זה הוביל לזיהוי ניק 104+ ששיפר את יעילות העריכה ל-0.86%. הוספת עריכות שקטות ששיבשו את ה-PAM של NGG2 והתקינו סביבו עריכות נוספות שיפרו עוד יותר את היעילות. האסטרטגיה הטובה ביותר, SE2, הביאה לשיעור עריכה ממוצע של 6.8%, שיפור של פי חמישה לעומת ניסיונות קודמים.

הצוות גם העריך גרסאות PE6 שהתפתחו לאחרונה, ומצא כי PE6b ו-PE6c שיפרו עוד יותר את תיקון F508del. באמצעות ה-epegRNA המותאם עם MLH1dn ו-+104 ngRNA, PE6c השיג את שיעורי העריכה הגבוהים ביותר. בתאי 16HBEge-F508del, שילוב של epegRNAs, עריכות שקטות, גרסאות PE6 ו-dsgRNAs שיפר את יעילות העריכה באופן משמעותי. האסטרטגיה היעילה ביותר השיגה שיעור תיקון F508del ממוצע של 51%.

בדיקת אסטרטגיה זו בתאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה מחולי CF הביאה לשיעור תיקון ממוצע של 25%, עם הצלה משמעותית של פעילות ערוץ CFTR. ניתוחים על היעד ומחוצה לו הצביעו על תוצאות עריכה לא מכוונות מינימליות, והדגימו את הדיוק של האסטרטגיה ואת הפוטנציאל ליישום טיפולי.

מסקנות

לסיכום, ניסויי PE3 ראשוניים הניבו תיקון ממוצע של 0.42%, תוך יישום התקדמות אחרונות, כולל pegRNAs מהונדסים (epegRNAs), PEmax, MLH1dn, עריכות שקטות, PE6 ו-dsgRNAs, הובילו לעד 11%, 58% ו-25% ממוצעים תיקון ב-HEK293T, 16HBEge-F508del ותאי אפיתל דרכי אוויר ראשוניים מחולי CF, בהתאמה.

שיפורים אלה הביאו להשפעות מינימליות מחוץ למטרה (≤0.1%). מערכת PE האופטימלית מציעה יחס תיקון-ל-indel גבוה ללא הפסקות DNA דו-גדיליות או תבניות DNA, מה שמפשט יישומים קליניים פוטנציאליים לטיפול בסיסטיק פיברוזיס.