בראיון זה, בוחן ד"ר ניימשי חדקה, מומחה ליישום מוצר בכיר ב- Thermo Fisher Scientific, את תפקיד הספקטרוסקופיה של ראמן ככלי אנליטי בתהליכים (PAT) במעקב ביולוגי, ומדגיש את הספציפיות המולקולרית שלו, יכולות בזמן אמת, וסטיות על שיטות אנליטיות מסורתיות כמו אולטרה-ראייה (Spectroscolet).
האם תוכל להסביר את העקרונות והתפקוד של ספקטרוסקופיה של ראמן?
ספקטרוסקופיה של ראמן היא טכניקה הבוחנת כיצד אור מתקשר עם מולקולות. כאשר האור מתקשר עם מולקולות רוטטות, רובו מקפיץ ללא שינוי – זה נקרא פיזור ריילי. עם זאת, חלק קטן מהאור עובר באנרגיה מכיוון שהמולקולות סופגות או משחררות כמויות קטנות של אנרגיה כשהן רוטטות – זה מכונה פיזור ראמן. למרות שהאור המפוזר הזה קלוש, הוא נושא טביעות אצבע מולקולריות ייחודיות, ועוזר למדענים לזהות ולמדוד חומרים שונים בדיוק.
מה הופך את הספקטרוסקופיה של ראמן למתאימה במיוחד לניטור ביולוגי?
ספקטרוסקופיה של ראמן מציעה ספציפיות מולקולרית, מה שאומר שהוא יכול לזהות מולקולות על סמך טביעות האצבע הספקטרליות המובחנות שלהן. ראמן עובד היטב גם בפתרונות על בסיס מים מכיוון שלמים יש אות ראמן חלש. מכיוון שמדובר בטכניקה אופטית ולא הרסנית, היא יכולה לנקוט במדידות תכופות ועשירות בנתונים מבלי להשפיע על המדגם. זה עוזר לתפוס וריאציות תהליכים בזמן אמת. ראמן יכול גם לאתר מטבוליטים מרובים בסריקה יחידה ללא דגימות משפילות, מה שהופך אותו לא יסולא בפז לסביבות ביו -דינאיות דינאמיות.
בנוסף, ספקטרוסקופיה של ראמן יכולה לאתר מספר תכונות חלבון מרכזיות, כולל אזורי אמיד I, II ו- III, החושפים פרטים על קשרי פפטיד ומבנים משניים. ראמן גם מרים שאריות ארומטיות כמו פנילאלנין וטריפטופן, כמו גם קשרים דיסולפידים. תובנות אלה עוזרות למדענים לפקח על התנהגות חלבון, לגלות צבירה ולהעריך תצורות מבניות.
המהירות של ניתוח ראמאן מועילה במיוחד בעיבוד ביולוגי. ניטור בזמן אמת מאפשר בקרת תהליכים מדויקת, כמו ליזום UF/DF בריכוזי חלבון ספציפיים. זה עוזר לשמור על איכות מוצר עקבית, מפחית עלויות וחוסך זמן. יתרה מזאת, ראמן יכול לעקוב בו זמנית בפרמטרים מרובים בו זמנית, ולשפר את ההבנה של הדינמיקה של ביו-מעבד לקבלת החלטות טובות יותר.
במה שונה ספקטרוסקופיה של ראמן מספקטרוסקופיה של UV-Vis במעקב אחר תהליכים במורד הזרם?
ספקטרוסקופיה של UV-Vis יכולה להיות מושפעת מחומרים אחרים במדגם, כמו טריפטופן, מה שמוביל למדידות ריכוז חלבון לא מדויקות. לעומת זאת, ספקטרוסקופיה של ראמן אינה מושפעת מהפרעות אלה, ומבטיחה נתונים אמינים יותר. זה יכול גם לכמת חלבונים וחומרים תמציות כמו סוכרוז והיסטידין בסריקה יחידה, מה שמאפשר תמונה שלמה יותר של התהליך.
לדוגמה, ביצענו ניסוי המתמקד במעקב אחר ריכוזי חלבון במהלך אולטרה -סינון/דיאפילטרציה (UF/DF) בייצור נוגדנים מונוקלונליים במורד הזרם. הביצועים של ראמן הושוו עם UV-Vis in in vis ו- UV-vis. התוצאות הראו את הדיוק הגבוה של ראמן (פחות מ- 5% שגיאה) והראו את יכולתו לספק נתונים אמינים גם בנוכחות תרכובות מפריעות כמו טריפטופן.
בנוסף, ספקטרוסקופיה של ראמן היא מאוד ספציפית, ומגלה רק את מולקולות היעד ללא הפרעה מאחרים. בניסוי שלנו, UV-vis הוערך על ריכוזי חלבון יתר על המידה ביותר מ- 70% כתוצאה מהפרעות טריפטופן. לעומת זאת, ראמן נמדד במדויק ריכוזים עם פחות מ- 10% שגיאה מכיוון שהטריפטופן לא השפיע על אותות הראמן באזורים הספקטרליים הממוקדים.
כיצד משולב ראמן בתהליכי ביו?
ניתן לשלב ראמן בתהליכי ביו בשלושה דרכים: קו בקו, קו או מקוון. In-Line משתמש בבדיקות שקועות המוצבות ישירות בתהליך לניטור ובקרה בזמן אמת. קו ה- AT דורש נטילת דגימות לניתוח לא מקוון, ואילו אונליין כרוך בצינורות דגימה להובלת חומר למכשיר הראמאן. ראמן מקוון יעיל ביותר לאיסוף נתונים ובקרת תהליכים רציפים, ומבטיח איכות מוצר עקבית.
יכולים להיות אתגרים עם ניתוח ראמאן כולל משמרות בסיסיות, הבדלי אורך נתיב וחפיפה ספקטרלית. סוגיות אלה מנוהלות בטכניקות עיבוד לפני נתונים כמו הסרת בסיס (באמצעות פילטרים כמו סביצקי-גולאי) ונורמליזציה (למשל, נורמליזציה של פס מים). טכניקות הפחתת ממדיות כמו רגרסיה חלקית פחות ריבועים (PLS) עוזרים לבנות מודלים כימומטריים חזקים לתחזיות מדויקות.
האם ניתן להשתמש בראמן ליישומים מתקדמים מעבר לניטור בסיסי?
כן, ראמן חורג מעקב בסיסי כדי לתמוך בבקרת איכות ביולוגית מכריעה, כגון מבנים משניים של חלבון וכימות חלבון. ראמן יכול לבודד ספקטרום ספציפי לחלבון מהפרעות חריגות ולנתח תוכן גיליון בטא או פרופילי צבירה בזמן אמת, ולהוכיח תובנות עמוקות יותר על יציבות התהליך ואיכות המוצר.
האם אתה יכול לסכם את הערך הכולל של הספקטרוסקופיה של ראמן בעיבוד ביולוגי?
כן, ספקטרוסקופיית ראמאן של תהליכים היא כלי רב-תכליתי לניטור ובקרה בזמן אמת בביו-עיבוד ביולוגי. בניגוד לשיטות מסורתיות כמו UV-VIV, הוא מספק מדידות ספציפיות מולקולריות ולא הרסניות, אפילו בתערובות מורכבות. היישום שלה מבטיח תוצאות באיכות גבוהה בתהליכים במעלה הזרם וגם במורד הזרם, מה שהופך אותו לפיתרון אמין וחסכוני לתעשייה הביו-תרופתית.
על ניימס חאדקה
ד"ר ניישש חאדקה הוא מומחה בכיר באפליקציות מוצרים ב- Thermo Fisher Scientific ובעל תואר שלישי בביוכימיה המתמקדת בטכניקות ביו -אנליטיות.
עם מומחיות נרחבת בספקטרוסקופיה ובכימומטריה, הוא מחויב להניע חדשנות באמצעות טכנולוגיה אנליטית של תהליכים (PAT). ד"ר חאדקה נלהב במיוחד להתמודד עם אתגרים מורכבים בעיבוד ביולוגי על ידי מינוף כלים מתקדמים. נכון לעכשיו, הוא נמצא בחזית הקידום של הספקטרוסקופיה של ראמן כפתרון מעשי ויעיל לניטור ובקרה על תהליכי ביו בתחום ה- PAT.
