על ידי שילוב של טכניקות מתקדמות לעריכת גנים, מדענים זיהו מוטציות מפתח המשפיעות על צמיחת הגידול ועמידות לתרופות בסרטן ריאות, ומציעות אפיקים חדשים לטיפולים מותאמים לסרטן.
מחקר: סריקה מולטי-מודאלית של וריאנטים גנטיים עם עריכת בסיס ופריים. קרדיט תמונה: Andrii Yalanskyi / Shutterstock
במחקר שפורסם לאחרונה בכתב העת טבע ביוטכנולוגיהחוקרים בשוויץ השתמשו בעריכה בסיסית ובעריכה ראשונית כדי ליצור ולנתח מגוון רחב של וריאנטים של הגן של קולטן גורם הגדילה האפיתל (EGFR) בשורות תאים מרובות, כולל סרטן ותאים שאינם סרטניים, כדי לחקור את השפעותיהם על התקדמות הסרטן והתרופה הִתנַגְדוּת. הם מצאו גם מוטציות ידועות וחדשות הקשורות באופן מובהק להפעלת EGFR ותגובת התרופה, מה שמדגים את דיוק השיטה וחושפים מסלולים חדשים המשפיעים על צמיחת הגידול ומנגנוני עמידות לתרופות.
רֶקַע
למרות ההתקדמות ברצף הגנום, מספר וריאנטים גנטיים נותרו מסווגים כווריאציות בעלות משמעות לא ברורה (VUS), מה שמקשה על אבחון וטיפול במחלה. זה בולט במיוחד בגרסאות EGFR המקושרות לסרטן ריאות לא קטן של תאים קטנים (NSCLC), שבהן כ-50% מהוריאנטים של EGFR הם VUS. הטיפולים הנוכחיים, כולל מעכבי טירוזין קינאז (TKIs) המכוונים ל-EGFR, יעילים פחות נגד מוטציות לא קנוניות, מה שמוביל לתוצאות גרועות ועמידות לתרופות. שיטות חדשות כמו מבחני מרובים ומסכים המבוססים על חזרות פלינדרום קצרות (CRISPR) מקובצות, מרווחות בקביעות, מסייעות להערכת גרסאות, אך כרגע אין להן את קנה המידה, הספציפיות והדיוק הדרושים לניתוח כל המוטציות האפשריות.
טכנולוגיית העריכה הבסיסית שיפרה את הדיוק אך היא מוגבלת על ידי עריכות לא מכוונות וסוגי מוטציות מוגבלים. עריכת Prime, שיטה מתקדמת יותר, מאפשרת החדרה מדויקת של מוטציות מגוונות, כולל הוספות ומחיקות, ומציעה דרך בעלת תפוקה גבוהה להעריך את הפתוגניות של VUS ולפתוח אפיקים חדשים בטיפול מותאם אישית בסרטן. במחקר הנוכחי, החוקרים השתמשו בשילוב של עריכה בסיסית ועריכה ראשונית כדי לבצע סריקות מוטציות ברזולוציה גבוהה של כל רצף הקידוד של הגן EGFR כדי לזהות מוטציות ידועות וחדשות הקשורות להתקדמות סרטן ועמידות לתרופות בסוגי תאים שונים.
לגבי המחקר
החוקרים השתמשו בתאי MCF10A, המסתמכים על EGFR מסוג פרא לצמיחה, כדי להעריך את הפתוגניות של גרסאות EGFR. הם הציגו מוטציות ספציפיות ב-EGFR המעודדות הפעלה באמצעות עורכי בסיס ציטוזין ואדנין (BE3.9max ו-ABE8e) באמצעות משלוח lentiviral, תוך שימוש בספרייה של 1,496 חומצות ריבו-נוקלאיות מדריך יחיד (sgRNAs) המכוונות לכל אקסונים של EGFR ואתרי רגולציה מרכזיים. לאחר עריכה ומניעת EGF, החוקרים רצפו sgRNAs כדי לזהות מוטציות המשפיעות על כדאיות התא. במסך מעקב, הם העריכו מוטציות EGFR הקשורות לעמידות לתרופות על ידי טיפול בתאי MCF10A עם gefitinib או osimertinib וניתוח ספריות sgRNA לזיהוי גרסאות חדשות ועמידות לתרופות.
כדי להרחיב את המסך המוטציוני שלהם, החוקרים השתמשו גם בעריכה ראשונית כדי להציג מגוון רחב יותר של מוטציות EGFR, כולל אלו ממאגרי ClinVar ו-COSMIC. הם הנדסו תאי MCF10A ללא הגן MLH1 כדי לשפר את יעילות העריכה הראשית וסיפקו RNAs מדריכים לעריכה ראשיים (pegRNAs) המכוונים ל-14 מוטציות EGFR ידועות ומשמעותיות באמצעות וקטורים lentiviral. הכללת מוטציות נרדפות ב-pegRNAs אפשרה לחוקרים לבחון את השפעתן על יעילות העריכה.
תוצאות ודיון
שני עורכי הבסיס השיגו יעילות עריכה של 95-97% בתאי MCF10A, עם מוטציות שהצטברו עם הזמן וכמה אללים הראו עריכות מרובות. המסך זיהה דלדול של sgRNA חיוניים, המאשר את יכולתו של המסך לזהות מוטציות הפוגעות בכדאיות התא. יש לציין, מוטציות המשפיעות על אתרי שחבור, שטויות ומוטציות פספוס ב-EGFR היו קשורות להשפעות של אובדן תפקוד.
המסך חשף מוטציות ידועות וכמה חדשות של EGFR הקשורות לעמידות לתרופות, במיוחד בכיס קושר ATP של תחום טירוזין קינאז של EGFR. עבור Gefitinib, זוהו מוטציות ידועות כמו Thr790Met, יחד עם מוטציות שלא אופיינו בעבר ליד כיס הקישור, כולל Val726, Met766 ו-Thr854, מאומתות כמעניקות התנגדות. עבור osimertinib, מוטציות כמו Thr790Ala;Gln791Arg ו-Val845Ala הועשרו, כמו גם מוטציות בתחום ה-C-terminal, מה שמצביע על מנגנונים ברורים לעמידות. ממצאים אלו הדגישו אינטראקציות תוך-מולקולריות ספציפיות ושינויים מבניים בתוך EGFR התורמים לעמידות כנגד TKIs שונים.
עריכת בסיס חשפה גם השקפה מגוונת של מוטציות המשפיעות על רגישות לתרופות. לדוגמה, המוטציה של Val845Ala הייתה עמידה לאוסמרטיניב אך רגישה לגפיטיניב, בעוד שמוטציות אחרות, כגון Lys852Glu, גרמו לעמידות לשתי התרופות. מוטציות משניות, כגון Thr790Met, הגבירו עוד יותר את העמידות בתאי PC-9 המוטנטיים של EGFR. עריכה ראשונית הציגה כמעט 92% מגרסאות EGFR המפורטות ב-ClinVar וב-COSMIC, וזיהתה מוטציות חדשות, כולל הכנסת אקסון 20 ומוטציות של תחום חוץ-תאי הקשורות לעמידות.
המחקר מדגים את החוזק של בסיס דיוק רב-מודאלי ועריכה ראשונית ומספק תובנות לגבי הפעלת EGFR ועמידות לתרופות. עם זאת, הוא הוגבל על ידי הסתמכותו על שגשוג בלתי תלוי ב-EGF כפרוקסי לאיתות EGFR ולא ניתח אינטראקציות קולטן או השפעות הטרוזיגוטיות. מחקרים עתידיים יכולים לטפל בבעיות אלה באמצעות מודלים סלולריים נוספים וקווי תאים מהונדסים.
מַסְקָנָה
לסיכום, המחקר הנוכחי פיתח מסגרת סריקה מוטציונית חזקה, ברזולוציה גבוהה, המשלבת את היכולות של עריכה בסיסית ועריכה ראשונית לניתוח וריאנטים גנטיים המעורבים בעמידות לתרופות וצמיחת גידול. הרחבת גישה זו למערך רחב יותר של אלמנטים גנטיים ומודלים תאיים, כולל תאים אנושיים ראשוניים, תסייע להאיר את הרלוונטיות הקלינית של וריאנטים גנטיים מגוונים ותתמוך בטיפול מותאם אישית בסרטן.
