צוות מדענים במעבדה הלאומית של משרד האנרגיה האמריקאי (DOE) ברוקהייבן ובאוניברסיטת קולומביה הדגים דרך לייצר כמויות גדולות של הקולטן שאליו נקשר SARS-CoV-2, הנגיף הגורם ל-COVID-19, על פני השטח. של תאים אנושיים. הקישור הזה בין החלבון הנגיפי הידוע לשמצה כיום לקולטן "ACE2" האנושי הוא הצעד הראשון של הדבקה בנגיף. יצירת חלבון ACE2 אנושי פונקציונלי בתאי עכבר נותנת למדענים דרך חדשה לחקור את הקולטנים הללו ואולי להשתמש בהם. בנוסף, כפי שתואר במאמר שפורסם זה עתה בכתב העת וירולוגיההשיטה יכולה להקל על חקר חלבונים מורכבים אחרים שהתגלו כקשים לייצור באמצעים אחרים.
המטרה הראשונית של מדענים ברוקהייבן, בתחילת המגיפה, הייתה לייצר כמויות גדולות של ACE2 אנושי ולאחר מכן לחבר את החלבון לננו-חלקיקים. לאחר מכן ניתן היה לבדוק את הננו-חלקיקים המצופים ב-ACE2 כתרופות אנטי-ויראליות ו/או כחיישנים לאיתור חלקיקי וירוסים.
"עבור כל אחד מהיישומים האלה, אתה צריך כמויות גדולות של חלבון, והחלבון צריך להיות פונקציונלי לחלוטין", אמר הוירולוג ברוקהייבן מעבדה פול פריימות', שהוביל את המחקר בשיתוף פעולה עם מדענים מהמרכז לננו-חומרים פונקציונליים (CFN) של מעבדת ברוקהייבן. "אבל הכנת חלבוני ממברנה פונקציונליים כמו ACE2 היא מאתגרת במיוחד מכיוון שהתהליך שבו החלבונים מתמקמים בקרום התא הוא מורכב."
אחת הסיבות היא שהחלבונים הללו משתנים בדרכים שונות לאחר סינתזה שלהם ולפני שהם מוכנסים לממברנת התא. בפרט, מולקולות פחמימות שנוספו לחלבונים ממלאות תפקידי מפתח הן כיצד שרשרת החלבון הארוכה מתקפלת למבנה התלת-ממדי הסופי שלה והן כיצד החלבון מתפקד בממברנה.
פחמימות מהוות כשליש מהמסה של חלבון ACE2."
פול פריימות', וירולוג מעבדת ברוקהייבן
התאים הפשוטים ביותר שמדענים משתמשים בהם כדי ליצור חלבונים באופן מלאכותי, כלומר חיידקים, חסרים את האנזימים להצמדת תוספות הפחמימות הללו. אז, צוות ברוקהייבן פנה לתאים מעכברים, אשר, כיונקים, דומים לנו יותר – ולכן מסוגלים לבצע את אותו סוג של עיבוד פחמימות. ידוע כי תאי עכבר מיומנים בקליטת גנים "זרים" ולביטוים. ובעוד שתאי עכבר מייצרים גם קולטן ACE2, גרסת העכבר של החלבון אינה נקשרת לספייק ה-SARS-CoV-2. זה אומר שלמדענים תהיה דרך קלה לראות אם תאי העכבר מייצרים את החלבון ACE2 האנושי – על ידי בדיקה אם הדוקרנים ייקשרו לתאים.
מציאת וביטוי הגן ACE2
כדי להגדיל את הסיכוי שתאי עכברים ישלבו ויקראו את הגן האנושי ACE2 בצורה נכונה, הקבוצה השתמשה בגן השלם. גנים מבני אדם ו"אורגניזמים גבוהים" אחרים מכילים מידע רב בנוסף לרצף ה-DNA המקודד לאבני הבניין של חומצות האמינו המרכיבות חלבון. מידע נוסף זה עוזר לווסת את מבנה הגנים ותפקודם בתוך הכרומוזומים של התא.
המדענים חיפשו בספריות של קטעי DNA משובטים שנוצרו כחלק מפרויקט הגנום האנושי – מאמץ בחסות DOE למפות את המיקומים של כל הגנים שהופכים אותנו לבני אדם – כדי למצוא מקטע שהכיל את הגן ACE2 השלם , שלם עם המידע הרגולטורי המוטבע שלו. לאחר מכן, הם חשפו תאי עכבר לננו-חלקיקים המצופים בשבר ה-DNA הזה בתוספת הגן לחלבון אחר שהופך את התאים לעמידים לאנטיביוטיקה קטלנית.
"במקרה זה, הננו-חלקיקים משמשים כחומר להעברת DNA שנבלע על ידי תאים כך שה-DNA יכול להשתלב בכרומוזומי תאי העכבר", אמר פריימות'. "כדי למצוא את התאים שקלטו את הגנים הזרים, אנו מוסיפים את האנטיביוטיקה לתרביות התאים. תאים שלא הצליחו לקלוט ולבטא את הגן העמידות לאנטיביוטיקה מתו, ואילו אלו שרכשו עמידות לאנטיביוטיקה שרדו וגדלו למושבות ."
המדענים הרחיבו כ-50 מהמושבות הללו לתרבויות בודדות ולאחר מכן בדקו אותן כדי לקבוע כמה קלטו גם את הגן האנושי ACE2 וייצרו את חלבון הקולטן האנושי.
זיהוי ייצור חלבון
"כ-70% מהמושבות העמידות לאנטיביוטיקה ביטאו את החלבון ACE2 האנושי על פני התא", אמר פריימות'. "ניתוח נוסף הראה שהמושבות הללו הכילו, בממוצע, 28 עותקים של הגן האנושי ACE2."
חשוב לציין, תאי העכבר החזיקו את עותקי הגן ה"זרים" של ACE2 והמשיכו לייצר את החלבון ACE2 האנושי המקודד על ידי גנים אלה במשך 90 דורות תאים לפחות.
רמת חלבון ה-ACE2 האנושי שיוצרו על ידי התאים הייתה פרופורציונלית בדרך כלל למספר עותקי הגן של ACE2 המשולבים בגנום העכבר. כמה מהשיבוטים של תאי עכבר ייצרו בערך פי 50 יותר ACE2 ממה שקיים בדרך כלל על תאי עכבר.
המדענים השתמשו במגוון שיטות כדי לבדוק אם חלבוני ה-ACE2 האנושיים שיוצרו בעכבר היו פונקציונליים. אלה כללו הדגמה ש"פסאודו-וירוס" המכיל את חלבון ספייק ה-COVID-, כלומר, סטנד-אין לא פתוגני ל-SARS-CoV-2-; עלול להיקשר לקולטנים ולהדביק את התאים.
"מבחני הדבקות אלה הראו שחלבון ACE2 האנושי המובע על תאי עכברים אלה מתפקד במלואו", אמר פריימוט.
שימושים והשלכות
בינתיים, Oleg Gang ו-Feiyue Teng, מחברי מחקר מ-CFN, חקרו דרכים שונות ליצור ננו-שלפוחיות חוץ-תאיות המועשרות ב-ACE2 אנושי מטעה לטיפול הפוטנציאלי ב-COVID-19. הם גם חוקרים את המיקום של חלבוני ACE2 על ננו-חלקיקים עבור יישומים פוטנציאליים בטיפול בזיהומים או זיהוי מהיר של וירוסים.
"האתגר שמציבים ננו-שלפוחיות מבוססות ACE2 טמון בהגברת השפעת הנטרול שלהן כנגד SARS-CoV-2. אנו גם מחפשים דרכים לשפר ולמנף את רגישות הקישור והספציפיות של ננו-חלקיקים המצמדים ל-ACE2 כדי להפוך אותם לשימושיים עבור וירוסים. אבחון. שתי הגישות ידרשו מאמצי אופטימיזציה עתידיים", אמר טנג, עמית מחקר ב-CFN שעבד רבות הן על ההיבטים הביולוגיים של מחקר זה והן על היישומים הפוטנציאליים המבוססים על ננו-מדעים.
"אנו נרגשים לשלב התקדמות בייצור ננו-חומר עם גישות ביו-מולקולריות לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות וחישה חדשות", אמר גאנג, בעל מינוי משותף באוניברסיטת קולומביה. "המחקר הזה אפשר לנו להתגבר על כמה בעיות מתודולוגיות שכן ננו-חומרים וביו-מערכות דרשו גישות אפיון שונות למדי. מה שלמדנו כאן חשוב לצעדים הבאים שלנו בשיפור חישה ביולוגית מבוססת ננו-חלקיקים".
בנוסף לאפשר יישומים אפשריים של חלבון ACE2 רקומביננטי, העבודה מדגימה גם גישה חדשה לייצור מגוון רחב של חלבונים מורכבים. דוגמאות לכך כוללות את המגוון העצום של קולטני פני התאים המתווכים אינספור תהליכים ביולוגיים ומחלות, כמו גם חלבונים בעלי חשיבות תעשייתית כמו נוגדנים חד שבטיים ואנזימים.
"השיטה שלנו להשתמש בגנים שלמים יחד עם תאי עכבר שניתן להתאים לגידול בתרביות תרחיף ענקיות – בדומה לתרביות המרק הנוזלי המשמשות לגידול חיידקים – יכולה לקדם את הייצור בקנה מידה גדול של חלבונים חשובים אלה ואחרים", אמר פריימות.
מחקר זה נתמך על ידי מענק מחקר ופיתוח מכוון מעבדה והשתמש במשאבים של המרכז לננו-חומרים פונקציונליים (CFN) במעבדה הלאומית ברוקהייבן. CFN הוא מתקן משתמש של משרד המדע של DOE הנתמך על ידי משרד המדע (BES).
