בראיון זה, ד"ר מישל צ'ן, מנהלת בכירה למדעים אנליטיים ב-Wyatt Technology, מדברת עם NewsMedical על איך להשתמש בטכניקות פיזור אור כדי לנתח חלבונים לכימות מרובה תכונות שלהם (MAQ).
מהן טכניקות פיזור האור השונות המשמשות לאפיון מקרומולקולות וננו-חלקיקים?
ישנן שלוש טכניקות פיזור אור המשמשות לאפיון מקרומולקולות וננו-חלקיקים: סטטי, דינמי ואלקטרופורטי.
פיזור אור סטטי מודד את עוצמת הזמן הממוצעת על פני זוויות פיזור מרובות. שיטה זו, הנקראת לעתים קרובות פיזור אור רב-זוויתי (MALS), מספקת מדידות משקל מולקולרי מוחלט של חלבונים וביו-מולקולות אחרות בתמיסה, ללא תלות בצורה. משקל מולקולרי נקבע על פי העוצמה הפזורת הכוללת יחד עם הריכוז המולקולרי, הנמדד בדרך כלל על ידי UV או רפרקטומטריה דיפרנציאלית (dRI).
MALS יכול גם למדוד את הגודל והריכוז של ננו-חלקיקים. כאן, התלות הזוויתית של האור המפוזר מניבה את גודלם של חלקיקים במונחים של רדיוס ממוצע ריבועי שורש, Rז. עבור חלקיקים כדוריים, ניתן להמיר זאת לרדיוס הכדור, וידע על הרדיוס יחד עם עוצמת הפזור הכוללת מניב ריכוז חלקיקים (חלקיקים/מ"ל).
קרדיט תמונה: ShutterStock/Kateryna Kon
MALS משמש לאפיון תרופות ביולוגיות כמו חלבונים, וירוסים הקשורים לאדנו (AAV) וננו-חלקיקים שומנים (LNP). מכשיר ה-DAWN MALS משולב בדרך כלל עם כרומטוגרפיה אנליטית של החרגת גודל, כרומטוגרפיה של חילופי יונים או פיצול זרימת שדה להפרדה ראשונית לפני הזיהוי, ומספקת ניתוח מפורט. מכשיר ה-UltraDAWN MALS, לעומת זאת, הוא גרסת הטכנולוגיה האנליטית לתהליכים (PAT) של DAWN, המשמשת לפיתוח, ניטור ובקרה של תהליכי ביולוגיים במורד הזרם בהיקפים שונים.
פיזור אור דינאמי (DLS) מודד תנודות בעוצמה באור המפוזר הנובע מתנועה בראונית של המולקולות או החלקיקים המוארים. על ידי ניתוח תלות הזמן של התנודות, ניתן לקבל את מקדם הדיפוזיה הטרנסלציוני, המשמש לחישוב הרדיוס ההידרודינמי או Rח. שילוב DLS עם SLS מאפשר הערכה של ריכוז החלקיקים, אפילו עבור מדגם הטרוגני עם אוכלוסיות בגדלים מרובים.
מכשיר DLS פופולרי אחד הוא DynaPro Plate Reader, המשמש בדרך כלל לסינון של עשרות עד מאות דגימות המייצגות תנאי ניסוח שונים או שברי תהליך. למשימות פשוטות יותר, ה-DynaPro NanoStar מודד את גודל החלקיקים וריכוזם במיקרו-קוובטות עם 2 μL של תמיסה.
פיזור אור אלקטרופורטי (ELS) היא טכניקת פיזור האור השלישית, הידועה גם בשם פיזור אור בניתוח שלב (PALS). הוא מודד את השינוי בתדר של קרן הלייזר המתרחשת הנגרם על ידי תנועה של דגימות טעונות בשדה חשמלי, שממנו ניתן לחשב מטען או פוטנציאל זיטה.
במה שונה כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC) מחלוקת זרימת שדה (FFF)?
גלאי MALS ו-DLS משמשים לעתים קרובות עם כרומטוגרפיה של אי-הכללה בגודל (SEC) או חלוקת זרימה בשדה (FFF), הידועה גם בשם חלוקת זרימת שדה א-סימטרית (AF4). הן SEC והן FFF מספקות הפרדה על סמך נפח ההידרודינמי של המדגם בעוד שתוספת של גלאים במורד הזרם מספקת אפיון מעמיק של התכונות הביו-פיזיקליות של המדגם.
קרדיט תמונה: ShutterStock/LuckyStep
SEC השתמשו בשלב נייח המורכב מחרוזים או שרפים נקבוביים, עם גדלים ספציפיים של נקבוביות. מולקולות קטנות יותר מתפזרות פנימה ומחוץ לנקבוביות, וכתוצאה מכך זמן שהייה ארוך יותר, בעוד מולקולות גדולות יותר נכנסות לפחות נקבוביות ולכן נפלטות מוקדם יותר ממולקולות קטנות יותר.
FFF מפריד מולקולות או חלקיקים בתעלה פתוחה, ללא שלב נייח. במהלך מצב הפליטה, יש שתי זרימות: זרימת ערוץ אופקית וזרימה צולבת אנכית. חלקיקים קטנים יותר מתפזרים כנגד הזרימה הצולבת בצורה יעילה יותר מאשר חלקיקים גדולים יותר ומתרחקים מתחתית התעלה. בשל פרופיל זרימת הערוץ הפרבולי, החלקיקים הקטנים יותר נישאים במהירות זרימה גבוהה יותר ביחס לחלקיקים הגדולים יותר, כך שסדר הפליטה ב-FFF הפוך בהשוואה ל-SEC, כאשר חלקיקים קטנים נפלטים ראשונים.
מכיוון שאין שלב נייח בתוך ערוץ FFF, הפרדת FFF לרוב מתאימה יותר מ-SEC עבור דגימות בעלות מימדים מעל 30 ננומטר, דגימות הנצמדות לעמודים ו/או כאלו הרגישות לגזירה.
מהם היתרונות העיקריים של SEC-MALS לניתוח AAV, וכיצד הם בהשוואה לשיטות אנליטיות אחרות? כיצד היית ממליץ להקים מערכת ולפתח שיטות SEC-MALS מתאימות למטרה לניתוח AAV?
הפרדת SEC יכולה לפתור אגרגטים ושברים אך אינה יכולה להפריד AAVs ריקים ומלאים. וירוסים ריקים ומלאים יפלטו באותו שיא, מכיוון שהם AAVs בעלי אותו רדיוס הידרודינמי. עם זאת, עם נתונים מגלאי ה-MALS והריכוז המקוונים, ניתן לחשב ריכוזים ריקים ומלאים עבור שיא המונומר של AAV ופסגות אחרות של עניין.
במנגנון יחיד, SEC-MALS מודד משקל מולקולרי וריכוז של קפסידים AAV ו-DNA מקופסת – בדומה למה שמקבלים מהשילוב של ELISA ו-ddPCR – עם מנת AAV של 10 – 100 μL בלבד, זמן ריצה קצר של 30 דקות וללא ריאגנטים, חוסך זמן וחומר תוך הגברת הדיוק והדיוק.
מודול ניתוח הווקטור הנגיפי בתוכנת ASTRA, המסופק על ידי Wyatt Technology, מחשב מספר CQA'ים ספציפיים ל-AV: הריכוז הגנומי הכולל של AAV Vg, ריכוז קפסיד AAV Cp, ו-Vg/Cp, יחס הקפסיד המלא לסך הכולל. ASTRA גם מחשבת את ריכוז ה-AAV הריק, פשוט Cp מינוס Vg, ואת התוכן המצטבר.
קרדיט תמונה: ShutterStock/Billion Photos
הגלאים הבאים מומלצים למערכת AAV אופטימלית לכימות מרובה תכונות (MAQ): מכשיר DAWN MALS, גלאי Optilab dRI וגלאי UV רב-גל. חשוב להקפיד על מקדמי הכחדה של קפסיד ו-DNA UV מדויקים, ספציפיים לסרוטיפ. טכנולוגיית Wyatt מספקת ברירת מחדל של מקדמי הכחדה המדויקים באופן סביר עבור כל סרוטיפים של AAV, אך ערכים מדויקים יותר עשויים להיקבע בשיטת ASTRA אחרת המשתמשת בגלאי Optilab ו-UV.
ערכי מקדם ההכחדה משמשים לאחר מכן עם מערכות MALS-UV-dRI או MALS-UV260-UV280 כדי לקבוע טיטר ריקים ומלאים מדויקים יחד עם Vg/Cp, זיהוי מינים מצטברים וכמויות מצטברות. מלבד ה-CQAs העיקריים שהוזכרו לעיל (תוכן קפסיד, טיטר קפסיד, טיטר גנום וצבירה), ניתן להשתמש באותה ריצת SEC-MALS לאפיון מורחב של משקל מולקולרי חלבון ו-DNA, שלמות קפסיד, גודל קפסיד ו-DNA חופשי.
תוכן צבירה הוא CQA חשוב. יש לציין שמכיוון ש-SEC עשוי לסנן או לשבש אגרגטים גדולים, FFF-MALS עשוי להתאים יותר לניתוח אגרגטים AAV.
מצב ה-SEC המצוין במדריך לנוהל ההפעלה הסטנדרטי (SOP) מספק הפרדה טובה של מונומרים, אגרגטים ושברים עבור סרוטיפים שונים של AAV. שיטת AAV SEC-MALS של Wyatt אומצה כשיטת פלטפורמה עבור לא מעט תוכניות AAV. הוא משמש למספר סרוטיפים ובשלבים שונים של פיתוח וייצור מסחרי.
אילו אתגרים מתעוררים באפיון LNPs בהשוואה לחלבונים ו-AAVs?
בהשוואה לחלבונים ו-AAVs, LNPs מאופיינים פחות טוב יחסית בשלב זה בשל החידוש שלהם והזמינות המוגבלת של כלים ספציפיים למודאליות לאפיון. המורכבות של LNPs נובעת מהגודל הגדול וההטרוגניות שלהם. בעוד שדגימות חלבון או AAV מציגות בדרך כלל מספר קטן יותר של מינים שונים, דגימות LNP מציגות לעתים קרובות התפלגות רציפה בגודל, במשקל מולקולרי ובעומס.
כמה תכונות פיזיות של LNPs, המפורטות להלן, נחוצות לאפיון וכימות. באמצעות שיטות קונבנציונליות, נדרשים כ-10 מבחנים שונים כדי לכסות רשימה זו.
DLS משמש לעתים קרובות כדי לנתח את גודל LNP ואת polydispersity לתמיכה בניסוח, פיתוח תהליכים ואופטימיזציה. עם זאת, DLS סובל מרזולוציה נמוכה בהשוואה לשיטות פיזור אור אחרות כמו SEC-MALS. אפילו כמות קטנה של אגרגטים גדולים יכולה לגרום לשינוי משמעותי בגודל הממוצע. כתוצאה מכך, תוצאות DLS הן לפעמים רק איכותיות.
מבחן הפלורסנט של RiboGreen נוצל באופן נרחב לכימות עומס RNA ויעילות המעטפת. עם זאת, מבחן ריכוז עקיף זה יכול להציג שגיאות ניסיוניות משמעותיות וריאציות ממשתמש למשתמש. יתר על כן, זה לא חושף את השונות במטען RNA או מינון עם גודל LNP.
קרדיט תמונה: ShutterStock/Kateryna Kon
על ד"ר מישל צ'ן
ד"ר מישל צ'ן היא המנהלת האב למדעי האנליטיקה בווייאט טכנולוגיהTMתיק של חברת ווטרסTM. היא השיגה את הדוקטורט שלה. מהמחלקה להנדסה כימית באוניברסיטת ייל, שם התמקדה בפיתוח גישות HPLC חדשות להפרדות במהירות גבוהה ויעילות גבוהה של ביו-פולימרים.
מאז הצטרפותו ל-Wyatt Technology, שילב ד"ר צ'ן פיזור אור רב-זוויתי וזיהוי פיזור אור דינמי עם HPLC וחלוקת זרימה בשדה, לאפיון פולימרים סינתטיים וביולוגיים, חלבונים וננו-חלקיקים.
בשנים האחרונות היא הובילה את צוות היישומים בווייאט לפיתוח שיטות חדשות לאפיון וכימות ביו-ננו-חלקיקים מתעוררים, כולל וקטורים ויראליים, ננו-חלקיקים של שומנים ושלפוחיות חוץ-תאיות.
על Wyatt Technology
Wyatt Technology, חטיבה של Waters Corporation, מפתחת מכשור, תוכנה וטכניקות לאפיון מקרומולקולות וננו-חלקיקים, בתמיסה, המבוססת על פיזור אור וטכנולוגיות נלוות. המאפיינים הפיזיקליים שנקבעו על ידי המוצרים של Wyatt כוללים מסה מולרית מוחלטת של חלבונים, פולימרים ומקרומולקולות אחרות; גודל ומטען (פוטנציאל זיטה); חלבון-חלבון ואינטראקציות ביו-מולקולריות אחרות; הרכב חלבונים מצומדים וקו-פולימרים; וקונפורמציה מקרומולקולרית.
מוצרים ושירותים
קו המוצרים של Wyatt כולל מכשירים ותוכנה עבור:
- פיזור אור רב-זוויתי מקוון (MALS), בשימוש בשילוב עם כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל כדי לכמת מסה טוחנית מוחלטת, גודל, קונפורמציה, צימוד וצבירה
- פיזור אור דינמי (DLS) מסורתי (מבוסס קובטות) ותפוקה גבוהה (מבוסס צלחת מיקרווול) לקביעת התפלגות גודל (רדיוס) וגודל, טמפרטורת המסת חלבון ופרמטרים המציינים יציבות
- ניידות אלקטרופורטית (PALS) לקביעת מטען מולקולרי/פוטנציאל זטה
- פיזור אור בהרכב-שיפוע לניתוח ללא תווית של אינטראקציות ביו-מולקולריות
- חלוקת זרימת שדה להפרדה של מקרומולקולות וננו-חלקיקים מ-1-1000 ננומטר, בשימוש בשילוב עם פיזור אור מקוון וטכנולוגיות זיהוי אחרות כדי לכמת מסה וגודל מולארי
Wyatt מציעה גם, על בסיס מוגבל, שירותי ניתוח דוגמאות תוך שימוש בטכנולוגיות הייחודיות שלה.
