במחקר שפורסם לאחרונה בכתב העת טֶבַעהציגו חוקרים את המבנה המולקולרי של דופמין טרנספורטר (DAT) מורכב עם קוקאין.
קוקאין ממכר מאוד, ושימוש לרעה בו עלול להחמיר הפרעות פסיכיאטריות. למרות שהוא מפעיל השפעות על ידי קשירה לטרנספורטרים של מונואמין, העיכוב שלו ב-DAT עומד בבסיס התכונות הממכרות והמתגמלות שלו. נכון לעכשיו, אין מבנים ניסיוניים של DAT אנושיים (hDAT). עם זאת, תובנות מהומולוגים, כמו בני משפחה של נשא מומס 6 (SLC6) ו תסיסנית מלנוגסטר DAT (dDAT), סיפקו מידע מבני.
מחקר: המבנה של טרנספורטר הדופמין האנושי במתחם עם קוקאין. קרדיט תמונה: Naeblys / Shutterstock
אלה חושפים ארכיטקטורה משותפת של 12 סלילים טרנס-ממברניים (TM1-TM12) בקפל פסאודו-סימטרי (קפל LeuT), עם אתר הקישור של המצע בליבה. בכל בני משפחת SLC6, ניתן לגשת לאתר קשירת המצע המרכזי מפנים הממברנה התוך-תאית או החוץ-תאית, עם אנרגיה להובלת המצע המופקת מיון נתרן (Na+) הובלה משותפת. בעוד שרבים תלויים גם ביוני כלוריד (Cl–), אם Cl– כרוך/מועבר נותר לא ברור.
Cl– קשירה ב-DAT עשויה להפחית באופן אלוסטרי את הזיקה של אתר הנתרן השני (Na2). אתר Na2 עשוי להיות נחוץ עבור איזומריזציה של טרנספורטר למצב הפונה פנימה לפני שחרור המצע, אשר לאחר מכן עובר לקונפורמציה פתוחה כלפי חוץ. בקומפלקס dDAT-קוקאין, קוקאין נקשר לאתר הקישור המרכזי של המצע. עם זאת, ל-dDAT יש הומולוגיה של רצף גבוהה יותר עם טרנספורטר הנוראדרנלין האנושי (hNET) מאשר עם hDAT.
המחקר והממצאים
במחקר הנוכחי, חוקרים ביצעו שחזור במיקרוסקופ קריו-אלקטרון (cryo-EM) של hDAT הקשור לקוקאין. ראשית, נעשה שימוש בתאי Expi293F לביטוי hDAT מתויג Twin-Strep (hDAT)תְאוֹם), אשר טוהר במיסלים של גליקו-דיוסגנין (GDN). התג הפחית את ספיגת הדופמין הכוללת, מה שמעיד על כך ש-hDATתְאוֹם היה בעל ביטוי נמוך יותר מאשר hDAT מסוג פרא כאשר ביטוי זמני בתאי COS7.
לאחר מכן, המבנה של hDATתְאוֹם קשור לקוקאין נפתר באמצעות cryo-EM ברזולוציה של 2.66 Å. היה לו מבנה פתוח כלפי חוץ עם 12 TMs שיצרו את קפל LeuT. TMs 11 ו-12 היו ממוקמים מחוץ לתחום הליבה, כאשר TM12 כמעט עקום באמצע הדרך. הלולאה החוץ-תאית 4 (EL4) יצרה מבנה דמוי סיכת ראש, שכיסה חלקית את היציאה מאתר הקישור המרכזי (S1).
המבנה הכללי דמה למבנים הפונים החוצה של טרנספורטר הסרוטונין האנושי (hSERT) ו-dDAT. החוקרים בדקו האם הליך הטיהור השפיע על המבנה הכללי. ככאלה, הם מדדו את הקישור לאנלוג של קוקאין ולא מצאו הבדלים בין הזיקות שלו ל-hDAT כאשר הוא מתבטא בתאי COS7 או מטוהרים במיצלות דטרגנט.
כמו כן, הזיקה לקוקאין לא הייתה שונה משמעותית. hDATתְאוֹם שוחזר לפרוטאו-ליפוזומים עם Na+ שיפוע, ונמדדה ספיגת דופמין תלוית זמן. נמדדה קליטה ספציפית, מה שמצביע על כך ש-hDATתְאוֹם יכול להניח את כל המצבים הקונפורמטיביים הדרושים להובלת מצע, אפילו לאחר טיהור.
קוקאין עיכב את פעילות התחבורה בקבוע עיכוב דומה לזה שבתאי COS7. מולקולת הקוקאין הייתה ממוקמת ב-hDATתְאוֹם ליבה במרחק האינטראקציה של שאריות S1. לאתר S1 יש שלושה אתרי משנה (A – C). האמין השלישוני בטבעת הטרופן של קוקאין יצר אינטראקציה יונית עם Asp79 באתר המשנה A. חוץ מזה, קוקאין התחבר לאתר B דרך טבעת הבנזן שלו, ויצר אינטראקציה מקצה אל פנים עם Tyr156.
שלוש מולקולות מים יצרו קשרי מימן סביב טבעת הבנזן, שניים מהם נעדרים במבנה dDAT. יתרה מכך, רק אתרי כלוריד ו-Na2 אוכלסו, בעוד שאתר הנתרן הראשון (Na1) קרס או מעולם לא התבסס על קשירת קוקאין. הבדל בין hDATתְאוֹם קומפלקסים -קוקאין וחזירי SERT (pSERT)- ו-dDAT-קוקאין היו המיקום של EL4.
במתחמי pSERT ו-dDAT, הלולאה תפסה מיקום דומה, אבל ב-hDATתְאוֹם מורכב, הוא נעקר 3.7 Å מ-TM1b יחד עם עקירה של 2.2 Å של Trp84 Cα. יתר על כן, מעטה של צפיפות לא חלבונית נצפתה בממשק בין ה- GDN micelle ל-hDATתְאוֹםקומפלקס קוקאין, שלא דווח עבור שחזורים של מונואמין טרנספורטר cryo-EM. צפיפויות אלו היו הטרוגניות והיו נוכחות בעיקר בפריפריה של hDATתְאוֹם.
ארבע מהצפיפויות הללו היו דומות בגודל ובצורה; שלושה היו ממוקמים באתרי כולסטרול שדווחו בעבר (CHOL1, CHOL2 ו-CHOL3), ואחד (CHOL4) היה ממוקם מתחת ל-CHOL3. החוקרים התאימו מולקולת כולסטרול חמי-סוקסינאט ב-CHOL2 ומולקולת כולסטרול בצפיפות ב-CHOL3. חוץ מזה, מודל כולסטרול הותאם לצפיפות ב-CHOL4. הדמיות דינמיקה מולקולרית הצביעו על כך ש-hNET מכיל אנלוגי CHOL4.
מסקנות
יחד, החוקרים פתרו את מבנה ה-cryo-EM של קומפלקס hDAT-קוקאין ב-2.66 Å. המבנה היה מבנה פתוח כלפי חוץ עם Na אחד+ קיים באתר Na2 וצפיפות המקבילה ל-Cl– זוהה באתר הכלוריד. יש לציין שהמבנה נפתר ללא שימוש בחומרים מולקולריים, המשמשים לעתים קרובות ב-cryo-EM של חלבוני ממברנה קטנים. ממצאים אלו מעמיקים את ההבנה של התכונות הממריצות והממכרות של קוקאין ועשויים לסייע בפיתוח תרופות ממוקדות להתמכרות.
