השערת "עולם ה-RNA" מציעה שהחיים המוקדמים ביותר על פני כדור הארץ היו מבוססים על RNA -; מולקולה חד-גדילית הדומה במובנים רבים ל-DNA -; כמו כמה וירוסים מודרניים. הסיבה לכך היא שבדומה ל-DNA, RNA יכול לשאת מידע גנטי, אבל כמו חלבון, הוא יכול גם לפעול כאנזים, ליזום או להאיץ תגובות. בעוד הפעילות של כמה אנזימי RNA -; הנקראים ריבוזימים -; נבדקו על בסיס כל מקרה לגופו, ישנם אלפים נוספים שנחזו מבחינה חישובית להתקיים באורגניזמים החל מחיידקים ועד צמחים ובעלי חיים. כעת, שיטה חדשה, שפותחה על ידי חוקרי פן סטייט, יכולה לבדוק את הפעילות של אלפי ריבוזימים חזויים אלה בניסוי יחיד.
צוות המחקר בדק את הפעילות של למעלה מ-2,600 רצפי RNA שונים, שצפויים להיות שייכים לקבוצה של אנזימי RNA הנקראים "ריבוזימים טוויסטרים", שיש להם את היכולת לחתוך את עצמם לשניים. כ-94% מהריבוזימים שנבדקו היו פעילים, והמחקר גילה שתפקודם יכול להימשך גם כאשר המבנה שלהם מכיל פגמים קלים. צוות המחקר זיהה גם את הדוגמה הראשונה של ריבוזים טוויסטר ביונקים, במיוחד בגנום של דולפין הבקבוק.
מאמר המתאר את המחקר הופיע באינטרנט היום, 5 בנובמבר, בכתב העת מחקר חומצות גרעין.
"בעוד ש-DNA הוא מולקולה דו-גדילית שיוצרת בדרך כלל מבנה סליל פשוט, ה-RNA הוא גדילי יחיד ויכול להתקפל בחזרה על עצמו, וליצור מבנים מגוונים, כולל לולאות, בליטות וסליל", אמר פיל בבילאקווה, פרופסור מכובד לכימיה ושל ביוכימיה וביולוגיה מולקולרית ב-Eberly College of Science בפן סטייט ומנהיג צוות המחקר.
תפקידם של אנזימי RNA מבוסס על מבנים אלה והם סווגו למספר מחלקות שונות. בחרנו להתמקד במה שנקרא 'ריבוזימים טוויסטרים' מכיוון שאחד מתפקידיהם הוא לבקע את עצמם לשניים, דבר שנוכל לראות על ידי קביעת הרצף הגנטי שלהם".
Phil Bevilacqua, פרופסור מכובד, Eberly College of Science, אוניברסיטת פנסילבניה סטייט
לפני מחקר זה, הוצעו כ-1,600 ריבוזימים טוויסטרים בהתבסס על הרצף הגנומי שלהם ותחזיות המבנה שלהם, אך רק קומץ אושרו בניסוי. הצוות פיתח צינור ניסוי שאיפשר להם להעריך את פעילות הביקוע העצמי של אלפי ריבוזים אלו בניסוי יחיד, אותו הם מכנים "Cleavage High-Throughput Assay", או CHiTA. הם גם זיהו כ-1,000 מועמדים נוספים לריבוזים טוויסטרים על ידי חיפוש ידני מדוקדק של ההקשר הגנומי סביב רצף קצר, שמור מאוד, המשותף לרבים מהריבוזימים בגנום של 1,000 אלפי אורגניזמים.
CHiTA מסתמך על שני גורמים מרכזיים. האחת היא טכנולוגיה שפותחה לאחרונה בשם "סינתזת אוליגונוקלאוטידים מקבילה מסיבית", או MPOS. MPOS נותן לצוות המחקר את היכולת לעצב ולאחר מכן לרכוש אלפי רצפי ריבוזים מגוונים בצורת חתיכות קטנות של DNA, והכל בבקבוקון אחד. לכל אחד מהרצפים שהם מעצבים יש הליבה שלו אחד מ-2,600 רצפי הריבוזים החזויים. לאחר מכן החוקרים מוסיפים פיסות דנ"א קצרות בשני קצוות המאפשרות להם ליצור עותקים של הדנ"א ולתעתוק אותו ל-RNA כדי לבדוק את פעילותו.
"עם MPOS, אנחנו יכולים פשוט ליצור גיליון אלקטרוני עם הרצפים שאנחנו מעוניינים בהם, לשלוח אותו לספק מסחרי, והם שולחים לנו חזרה צינור שמכיל כמות קטנה מכל רצף", אמרה לורן מקינלי, סטודנטית לתואר שני. בפן סטייט בזמן המחקר, שקיבל לאחרונה דוקטורט, ומחבר ראשון של המאמר. "עבור CHiTA, אנחנו צריכים הרבה מכל רצף, אז אנחנו מוסיפים סיביות של DNA לכל קצה של הרצפים שמאפשרים לנו ליצור מיליוני עותקים של כל אחד מהם באמצעות טכניקה שנקראת PCR, אבל סיביות נוספות אלה עלולות להשפיע על היכולת שלנו לבדוק את הפונקציות של ריבוזימים."
גורם המפתח השני עבור CHiTA עוזר להתגבר על מכשול זה על ידי הסרת קטעי רצף נוספים אלה באמצעות חלבון -; הנקרא אנזים הגבלה -; שחותך DNA ברצפים קצרים ספציפיים הנקראים אתרי זיהוי. עם זאת, רוב אנזימי ההגבלה חותכים את ה-DNA איפשהו קרוב לאמצע אתרי הזיהוי שלהם, ומשאירים חלק מרצף אתרי הזיהוי מחובר לשני שברי ה-DNA שנוצרו שעדיין עלולים להשפיע על המבנה והתפקוד של ריבוזים.
"מצאנו אנזים הגבלה שחותך את ה-DNA במרחק קצר מאתר הזיהוי שלו, כך שנוכל לעצב את הרצפים שלנו כך שהוא יחתוך מבלי להשאיר זכר ל-DNA נוסף", אמר מקינלי. "בדרך זו נוכל להבטיח שאנו מעריכים את תפקוד הרצף המדויק של הריבוזימים."
במעבדה, הצוות מייצר תחילה עותקים נוספים של הרצפים שהוזמנו דרך MPOS, חותך כל DNA נוסף עם אנזים ההגבלה, ולאחר מכן הם יכולים לתמלל RNA מרצפי ה-DNA. אם אחד מהרצפים מקודד לריבוזימים פעילים, כאשר ה-RNA מיוצר, הם יתקפלו במהירות לתוך המבנה התפקודי שלהם ויבקעו את עצמם. לאחר מכן החוקרים יכולים לאסוף את ה-RNA ולהמיר אותו בחזרה ל-DNA -; נקרא cDNA -; כדי שהם יוכלו לקרוא את הרצף שלו כדי לראות אם הוא באורך מלא או אם הוא נבקע.
"כאשר אנו מרצפים את ה-cDNA, אנו יכולים לראות כמה מה-RNA, אם בכלל, נבקע כאינדיקטור לפעילות ריבוזים", אמר מקינלי. "עבור כ-94% מהרצפים שבדקנו, חלק ניכר מה-RNA נבקע. למעשה, האחוז של כל ריבוזים פעיל שנבקע די דומה למאמצים קודמים שבדקו ריבוזימים בנפרד".
לאחר מכן, הצוות בחן את המבנים החזויים של הרצפים שהם בדקו וראה שלרבים מהם היו שינויים קלים או פגמים בהשוואה למבנה הריבוזים הטוויסטר הקנוני, ובכל זאת הם עדיין התפצלו בעצמם. זה הציע לחוקרים שתפקודם של הריבוזימים סובלני מאוד לשינויים מבניים קלים, כלומר הם עדיין יכולים לפעול גם אם לא נוצרו בצורה מושלמת.
סובלנות לפגמים מעידה על כך שייתכן שיש עוד טוויסטרים חבויים בטבע שלא יימצאו באמצעות פרמטרי החיפוש המקוריים, על פי הצוות. למעשה, מתארים חדשים המבוססים על רצפים במחקר זה הובילו את צוות המחקר לגלות את הריבוזים הטוויסטר של היונקים הראשון, שזוהה בגנום של דולפין הבקבוק.
"הבנת סוגים אלה של סובלנות לרצף ושונות מבנית בריבוזימים תעזור לנו לתכנן דרכים חדשות וקפדניות לזהות אותם", אמר Bevilacqua. "הידע הנוכחי שלנו על תפקוד ריבוזים מבוסס ברובו על כימיה, ואנחנו רק מתחילים ללמוד על תפקידם בביולוגיה. היכולת לבחון את פעילותם במבחן בקנה מידה גדול כמו CHiTA תקווה להאיץ את היכולת שלנו למצוא ריבוזימים חדשים. ולהבין טוב יותר את התפקיד שהם ממלאים בתא כל זה יכול גם לעזור לנו לעבוד אחורה בזמן כדי לראות מה יכול היה להיות אפשרי כשהיכולת של RNA לעשות את הכל עשויה להיות מפתח להזנקת חיים על כדור הארץ המוקדם. "
