בראיון זה עם Datilin Life Sciences, פרופ 'ד"ר קריסטינה קוש-וייהרוג, ראש המכון לפיזיולוגיה באוניברסיטת לוב, מדבר על הננו-מכניקה של תאים חיים והשלכותיהם על מחלות לב וכלי דם.
האם תוכל להתחיל בהצגת הקוראים שלנו את המחקר שלך על תאי אנדותל ואיזה תפקיד תאים אלה ממלאים?
התחלתי פרויקט מחקר כפוסט -דוק, בודק את התפקיד של תאי האפיתל. עם התפתחותה של עבודה זו, זיהינו כי תאי האנדותל המצפים את החלק הפנימי של כלי הדם משפיעים מאוד גם על מערכת כלי הדם. תאים אלה נושאים הרבה תעלות יונים בקרומי הפלזמה שלהם והם גמישים ביותר, כלומר הם יכולים להגיב לכוח הדם הזורם.
מיקומם בתוך כלי הדם חשוב מכיוון שתאי האנדותל יכולים לחוש את כל מה שמגיע עם הדם, ומאפשרים להם להגיב בהתאם. לדוגמה, תאי אנדותל יכלו לחוש גורמים vasoactive ולספק אותות לתאי השריר החלקים של כלי הדם הסובבים אותם.
תאים אלה יכולים להיות מעוותים גם על ידי כוחות המופעלים על ידי הזרמת דם. כאשר הם מעוותים, הם מגיבים בצורה מסוימת, וכתוצאה מכך גורמים אווסו -קונסטרקטוריים או vasoconstrictory המסייעים בוויסות כלי הדם.
זיהינו כי התנהגות תאים זו חשובה במיוחד מבחינת הפיזיולוגיה הפסיבית. מכיוון שהם גמישים ומעוותים, תאי האנדותל יכולים לעבור בין מצבים מכניים שונים. בדרך כלל הם מראים התנהגות תקינה ובריאה, אך כאשר קורה משהו בגוף, כמו מחלה או דלקת, התאים משנים את התנהגותם ותכונותיהם המכניות. זה ידוע בשם תפקוד לקוי של האנדותל.
קרדיט תמונה: חוסה לואיס קאלבו/Shutterstock.com
איזו השפעה יש לקשיחות תאים ותכונותיהם המכניות של התאים על הגוף? כיצד אנו מודדים את המאפיינים הללו?
אנזים הנקרא ה- ENOS (סינתז תחמוצת החנקן האנדותל) נמצא מתחת לקרום הפלזמה. אנזים זה התגלה לפני שנים רבות. כאשר התאים הם רכים ומעוותים, הציטוס שלד שלהם מפולמר.
הזרמת דם יכולה להפעיל אנזים זה, מה שמניע מפל של ארגינין וחומרים אחרים. NO מיוצר על ידי תאי אנדותל כתגובה לעיוות זה מזרם הדם, וגורם לעלייה בקוטר כלי, ובתורו, ירידה בלחץ הדם.
מנגנון חשוב זה מחובר למשטח התא, שהוא 150 עד 200 ננומטרים משכבת התא החיצונית. הגליקוקליקס ממוקם על גבי קרום הפלזמה; השכבה שמתחת לקרום הפלזמה נקראת ציטוס שלד קליפת המוח.
איזה תפקיד ממלאת הגליקוקליקס בתאי האנדותל ובקשיחות תאים? כיצד נמדדים בדרך כלל את זה?
הגליקוקליקס הוא מבנה מרתק, ואחד הגורמים החשובים ביותר בתפקוד האנדותל הוא שלמות הגליקוקליקס.
AFM הוא המכשיר המושלם למדידת הגליקוקליקס. אנו יכולים להשתמש ב- AFM כדי למדוד זאת על ידי נגיעה בגליקוקליקס עם קצה כדורי קטן 1 מיקרומטר ועם כוח טעינה נמוך מאוד בטווח של 0.5 ננוונטונים.
מבנה הגליקוקליקס הוא גמיש ופגיע ביותר, ולכן איננו יכולים להשתמש בכוחות העמסה גבוהה. הננומטרים הראשונים של התא המוטבע מהווים את הגליקוקליקס; ככל שאנו מכניסים יותר, אנו נוגעים לפני השטח של תא האנדותל, קרום הפלזמה ובציטוס שלד הקליפת המוח.
עקומת ה- AFM שהתקבלה כוללת מספר מדרונות ויכולה לקחת שבועות לניתוח. הצלחנו להשתמש באנזימים כמו הפרינאז כדי להסיר את הגליקוקליקס באופן אנזימטי, ומאפשר לנו לכמת את הגובה והתכונות המכניות של הגליקוקליקס ואת התכונות המכניות של קליפת המוח.
לגליקוקליקס יש מבנה דמוי רשת הבנוי על גורמים רבים של גליקופרוטאינים ופרוטאוגליקנים. לדוגמה, הפראן סולפט הוא תרכובת חשובה של הגליקוקליקס. הגליקוקליקס בונה מבנה מגן כלי הדם על גבי התאים. כימות זה יכול להיות מאתגר, אך ה- AFM מתאים באופן אידיאלי למשימה זו.
שיחות על AFM #3: תובנות של מדען, ננומכניקה בתאים חיים
קרדיט וידאו: Bruker BioAfm
האם הניסויים שלך מבוצעים בתרבית תאים, ואילו סוגי תאים אתה עובד בדרך כלל?
אנו משתמשים בכמה דגמים שונים. HUVEC הם תקן הזהב שלנו, ואנחנו מבודדים טריים אלה מהוריד הטבור כאן, לאחר המקור תאים מבית החולים באוניברסיטת לובק.
תאים אלה מהווים אתגר בעת הניתוח; לדוגמה, אנו עשויים להשתמש ב- CRISPR-CAS כדי להפיל ערוצים ספציפיים בתא.
אני מעדיף לעבוד לשעבר Vivoבעזרת כלי דם מעכברים או מטופלים ופיצולם פתוחים כך שתאי האנדותל פונים כלפי מעלה. זה מאפשר לנו למדוד את תאי האנדותל הללו לשעבר Vivo כלי דם. זה אידיאלי מכיוון שאנו יכולים להשתמש בכלי חולים או במודלים שונים של עכברים, כולל תאי עכבר מהונדסים.
הכנת הגליקוקליקס לוקח זמן בעת טיפוח תאי האנדותל. לרוב זו בעיה במעבדות אחרות המתרבות את תאי האנדותל שלהם במשך יומיים בלבד, למשל, מכיוון שזה לא מספיק זמן להכנת גליקוקליקס נאותה.
תאים בתרבות ו לשעבר Vivo טלאי ההכנה זקוקים לזמן, לפחות שלוש עד ארבע פעמים עד להתאושש הגליקוקליקס וניתן למדוד אותו.
לחץ דם גבוה הוא ככל הנראה מחלת כלי הדם הידועה ביותר, כאשר כ- 50% מהמבוגרים חשבו שיש להם יתר לחץ דם, על פי ה- CDC. יתר לחץ דם גורם לקשיחות תאים מוגברת בכלי הדם, מה שעלול להוביל לדלקת ולבעיות משניות. איך אתה רואה את העבודה שלך מתורגמת ישירות למחקר רפואי, למשל, עם יתר לחץ דם?
ניתן לתאם ישירות את קשיחות האנדותל לקשיחות העורקים. קבענו זאת באמצעות פרויקט בו עבדנו עם קבוצות חולים שונות. כדי למדוד זאת השתמשנו ב- HUVECs סטנדרטיים ודגרנו את אלה בסרום המטופל, כולל תרכובות פתולוגיות.
מצאנו כי גורמים בסרום המטופל פגעו קשה בגליקוקליקס והקשיחו את קליפת המוח. ניתן לתאם את קליפת המוח הנוקשה הזו לקשיחות העורקים שנמדדה כמהירות גל הדופק.
הממצאים שלנו ברמה היחידה היו נכונים גם לחלקים משמעותיים במערכת העורק. מצאנו את התכווצות כלי הדם המקומית, למשל, אך במקרה של מחלה דלקתית, אני משוכנע שהתנהגות תאי האנדותל משפיעה על מערכת העורקים.
האם תוכל גם לשתף קצת תובנות מהמחקר שלך על טרשת מערכתית ונוקשות תאים והרכיבים הגלובליים שלדעתך ממלאים תפקיד באלה?
עבודה זו היא פרויקט מתמשך, וכיום יש לנו נתונים ראשוניים, במיוחד על נוגדנים אוטומטיים כמו אלה הקשורים ל- SARS -COV -2.
מחלות דלקתיות גורמות לכך שהגוף יוצר יותר נוגדנים אוטומטיים, אם כי תהליך זה יכול להיות 'קופסה שחורה'. נוגדנים אוטומטיים אלה נקשרים כנגד, למשל, קולטנים מצומדים חלבון G כמו קולטני אנגיוטנסין II, ומשנים לחלוטין את משטח האנדותל.
כחלק מתהליך זה, הגליקוקליקס פגום, כאשר גובהו שטוח לחלוטין. זהו למעשה שפיכה של הגליקוקליקס וקליפת המוח הנוקשה יותר. ההשערה העובדת שלנו היא שבמחלות דלקתיות כמו טרשת מערכתית אנו רואים את התגובה העצמית של הגוף, וכאשר נוגדנים אוטומטיים אלה נקשרים לקולטנים אלה, אנו רואים מפלס ספציפי המוביל לתהליכים דלקתיים.
קולטנים אלה קשורים כולם לציטוס שלד קליפת המוח. זהו שלד ציטוס ספציפי מתחת לקרום הפלזמה. זה לא סיבי הלחץ בתא; במקום זאת, זהו תא צר מאוד בסביבות 200 ננומטרים מראש פני התא. רשת אקטין-מיוזין זו כוללת חלבוני קישור וקולטנים, כאשר הגליקוקליקס מקושר לאקטין באמצעות Syndecan או Perlecan.
מחלות דלקתיות מובילות לשפיכת הגליקוקליקס או התקשורת קליפת המוח, הנגרמת כתוצאה מפילמור של האקטין הקורטיקלי ואות מהותי, מה שמוביל לקריסת הגליקוקליקס.
אנו יכולים לתפעל את ציטוס שלד האקטין כדי לחקור זאת, באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנט כדי להתמקד בציטוס שלד קליפת המוח. המחקר שלי מתמקד באקטין קליפת המוח הזה, ולכן מיקרוסקופ קונפוקלי שימושי.
מניפולציה של ציטוס שלד קליפת המוח כרוכה בשימוש בג'ספלקינוליד כדי לפולימר את רשת האקטין, או שאנו יכולים להשתמש בציטוכלאסין D כדי להפיל אותו. מניפולציה של סיבי אקטין מתחת לקרום הפלזמה מביאה לתגובות מהגליקוקליקס, כאשר קליפת המוח הנוקשה מובילה להתמוטטות של הגליקוקליקס וקליפת המוח הרכה המעניקה גליקוקליקס זקוף ונכון.
מהם כמה מהאתגרים הנוכחיים עבור סוג זה של מחקר?
מדידות ה- AFM הראשונות שלי באמצעות מכשירים מוקדמים היו מאתגרים, אך AFMs מודרניים הם הרבה יותר ידידותיים למשתמש. האתגר האמיתי הוא עבודה עם סוגים אלה של תאים. חובה שנטפל בתאים באופן פיזיולוגי מכיוון שהם תאים חיים, ורק תא חי בסביבה מושלמת יכול לפעול כראוי כמו תא חי.
לדוגמה, גורמים כמו pH ותכולת מלח חייבים להיות אופטימליים, עם זמן גידול מתאים בכל מקרה. חשוב ללמוד את המורפולוגיה והתנהגותם של תאי האנדותל לפני הניסוי. יש צורך בניסיון רב בעבודה עם ניסויים בתרבית תאים כדי לאשר שהתאים במצב טוב לפני הניסוי.
לאן אתה חושב שעתיד AFM יוביל, ואיזה תפקיד הוא ימלא עבור מדענים בעתיד?
AFM היא אחת השיטות הטובות ביותר לכימות מכניקת תאים באופן אמין. זה מאפשר לי להציג באופן מקוון כיצד תא חי מגיב כשאני מיישם חומרים. הייתי רוצה לראות מדידות סטנדרטיות יותר, כלומר אנו יכולים להשתמש ב- AFM ככלי אבחון.
לדוגמה, חולי מחלת כליות כרונית דורשים לרוב ביופסיות בכליה, הכואבות. ממחקר הקבוצה שלי, אני יודע שכאשר אנו משתמשים בסרום המטופל ודגרים חובבים סטנדרטיים עם זה, אנו יכולים להבדיל בין מחלת כליות כרונית בין שלב, ארבע וחמש.
בעזרת סרום המטופלים אנו יכולים לראות הבדלים משמעותיים בקשיחות קליפת המוח ובגובה הגליקוקליקס. שיטה זו אינה פולשנית, ובעוד שלוקח זמן ליצור את עקומות הכוח הדרושות, יהיה כדאי לשלב את ה- AFM ככלי אבחון בפרויקטים ותרגום מרפאות.
אנחנו לא רחוקים מהמציאות הזו. בפרויקט הנוכחי שלנו, למשל, אנו יכולים למדוד תפקוד לקוי של האנדותל. תא נוקשה או תא עם גליקוקליקס פגום הם סימני היכר של תא לא מתפקד. אנו יכולים לבצע אבחון אלה בפרויקטים של מעבדה, אך הקלינאים אינם ששים להשתמש בגישה זו כרגע בגלל המורכבות של המכונה המעורבת.
אני מנסה לשכנע קבוצות שונות לנסות גישה זו, כאשר הקלינאים נותנים לנו סרום והצוות שלי מספקים פרטים על תפקוד לקוי של האנדותל.
על פרופ 'ד"ר קריסטינה קוש-וייהרוג
פרופ 'ד"ר קריסטינה קוש-וייהרוג הוא מנהל מכון לובק לפיזיולוגיה בגרמניה ובוועדה של קרן יתר לחץ דם גרמנית. בשנת 2018 היא קיבלה את פרס האגודה הגרמנית לנפרולוגיה למחקר על יתר לחץ דם. מחקריה מתמקדים, בפרט, על השפעת תהליכים דלקתיים על תפקוד לקוי של האנדותל כמבשר להתפתחות מחלות לב וכלי דם.
