לִלמוֹד: אבולוציה מכוונת של חלקיקים מהונדסים דמויי וירוסים עם יעילות ייצור והתמרה משופרת. קרדיט תמונה: Dragon Claws / Shutterstock.com
מחקר שפורסם לאחרונה בכתב העת טבע ביוטכנולוגיה דן בפיתוח של מערכת חדשה לאבולוציה מכוונת של חלקיקים דמויי וירוס מהונדסים (eVLPs) עם יכולות התמרה וייצור משופרות.
מה הם eVLPs?
היכולת להעביר ביעילות ובבטחה מקרומולקולות לתאים בַּמַבחֵנָה ו in vivo חיוני עבור שיטות טיפול שונות. למרות שווקטורים של נגיף אדנו (AAV) יכולים לספק בהצלחה סוכנים לעריכת גנים in vivoהם קשורים למספר מגבלות.
לכן, יש צורך בשיטות משלוח נוספות כדי להתגבר על מגבלות אלו. VLPs כוללים פיגומים ויראליים שאורזים ומספקים חומצות ריבונוקלאיות (mRNA), חלבונים או ריבונוקלאופרוטאין (RNP). VLPs מציעים התמרה יעילה, טרופיזמים של רקמות, עריכה מופחתת מחוץ למטרה וביטוי מטען חולף.
בעבר, מחברי המחקר הנוכחי פיתחו eVLPs המאפשרים עריכת גנים יעילה ואספקת חלבון בַּמַבחֵנָה ו in vivo. בתוך מערכות אלו, חלבוני מטען מתמזגים לחלבוני Gag רטרו-ויראליים ב-eVLPs, המכוונים לוקליזציה של מטען לחלקיקים ויראליים תוך כדי היווצרותם. קישור ה-cargo-Gag מכיל רצף שיבקע על ידי פרוטאז רטרו-ויראלי לאחר היווצרות החלקיקים, אשר לאחר מכן משחרר את המטען בתוך החלקיקים ואל התאים המועברים.
ממצאי המחקר
החוקרים פיתחו מערכת אבולוציה מעבדתית מכוונת עבור eVLPs. בתחילה, הזהות של וריאנטים של eVLP הובהרה באמצעות RNAs חד-מדריך (sgRNAs) מקודדים על מנת לאפשר בחירה של וריאנטים רצויים עם מאפיינים ספציפיים. לאחר מכן פותחה התאימות של sgRNAs מקודדים לייצור eVLP פונקציונלי, ובעקבותיו הוכנס רצף ברקוד של 15 זוג בסיסים לטטרלופ של פיגום ה-sgRNA.
הדור הרביעי (v4) עורך בסיס (BE)-eVLPs, אשר אורזים מטען פעיל של אדנין BE (ABE) RNP, שימשו עבור ניסויי האימות. סטנדרטיים v4 BE-eVLPs הופקו על ידי העברה משותפת של ארבעה פלסמידים לתוך תאי יצרן, אשר קידמו את היתוך Gag-ABE, Moloney murine leukemia virus (MMLV) Gag-Pro-Pol polyprotein, vesicular stomatitis virus G envelop protein, ו-sgRNA המכוון על -עריכת בסיס יעד.
לאחר מכן, יוצרו והשוו רכיבי v4 eVLPs המכילים sgRNAs בקוד קנוני עם ארבעה ברקודים שנבחרו באופן שרירותי על ידי מדידת יעילות העריכה הבסיסית שלהם. נמצא כי eVLPs מקודדים מפגינים עוצמה דומה ל-eVLPs סטנדרטיים, ואילו eVLPs עם sgRNA מקודדים ברורים היו בעלי עוצמה דומה. יתר על כן, eVLPs חסרי היתוך Gag-ABE ארוזות פי 216 פחות sgRNAs מאשר eVLPs קנוניים v4.
ניסויים נוספים הצביעו על כך שניתן להשתמש ב-sgRNA עם ברקוד לתיוג גרסאות eVLP ברורות ושברקודים שהועשרו לאחר בחירה מזהים גרסאות עם כושר משופר.
מערכת אבולוציה זו יושמה אז כדי לבצע מוטציה ולבחור קפסידים עם תכונות משופרות. לשם כך, נוצרה ספריית קפסיד eVLP מקודדת המכילה 3,762 מוטנטים בעלי שארית בודדת של קפסיד חלבון MMLV Gag ודומיינים נוקלאוקפסידים במטען Gag-ABE.
ספריית ברקוד זו שימשה לבניית ספרייה של תאי מפיק eVLP מקודדים. התמרה לנטי-ויראלית של תאי יצרן, ואחריה התרחבות של תאים שעברו התמרה, הגבירו את החלק של תאי היצרן עם זוג וריאנטים יחיד של ברקוד-קפסיד.
ספריית קפסיד eVLP מקודדת הייתה כפופה לשתי בחירות לייצור משופר מתאי יצרן והתמרה של תאי HEK293T, בהתאמה. לשם כך, ייצור eVLP הוחל מספריית תאי היצרנים המקודדים, כשהספרייה שנוצרה של גרסאות קפסיד מטוהרת.
לאחר מכן בודדו sgRNAs ארוזים ב-eVLP, וברקודים שנכחו לאחר בחירת ייצור זו רוצו ברצף. ההעשרה של ייצור eVLP נאמדה עבור כל רצף ברקוד, אשר זיהתה ברקודים עם העשרה מוגברת בהשוואה לאלו של קפסידים eVLP קנוניים. לכ-8% מהמוטנטים של קפסיד בספרייה הייתה העשרת ייצור גבוהה יותר מהקפסיד הקנוני eVLP.
תאי HEK293T הודגרו עם ספריית קפסיד eVLP מטוהרת. לאחר שש שעות בודדו sgRNAs שהועברו לתאי מטרה, והעשרת ההמרה של eVLP חושבה עבור כל רצף ברקוד.
רק ל-0.7% מכל המוטנטים של קפסיד הייתה העשרה ממוצעת של התמרה גבוהה מזו של הקפסיד הקנוני v4 eVLP. למרות שלרוב מוטנטים הקפסיד היו יעילות התמרה וייצור גרועה יותר מהקפסיד הקנוני v4 eVLP, אף מוטנט לא הציג שיפורים בייצור או בהתמרה שלהם, ובכך מצביע על כך שמנגנונים שונים ומתחרים מכתיבים את היעילות שלהם.
מספר מוטנטים נבחרו לניתוחים נוספים בהתבסס על העשרה חיובית של ייצור או התמרה. מוטנטים ששיפרו נכס אחד מבלי לפגוע באחר קיבלו עדיפות.
החדרת מוטציות קפסיד למבנה Gag-ABE לא העלתה את העוצמה. זה הוביל את החוקרים להעריך את עוצמתם של מוטציות קפסיד במבנה Gag-ABE עם מוטציית Q226P, שהועשר בצורה החזקה ביותר בבחירת הייצור במבנה Gag-Pro-Pol (GagQ226P-פרו-פול).
מוטציות קפסיד שונות הגדילו את עוצמת האספקה של BE עד פי שלושה בהשוואה ל-v4 eVLPs. לחמש מוטציות, כולל C507V, C507F, A505W, D502Q ו-R501I, הייתה העוצמה הגבוהה ביותר; עם זאת, שילוב מוטנטי אחד, GagC507V-ABE עם GagQ226P-Pro-Pol, היה בעל עוצמה משופרת פי 3.7 והוא הוגדר כ-BE-eVLPs מהדור החמישי (v5).
הושוו עוצמתם של v4 ו-v5 BE-eVLPs, מה שהצביע על כך של-v5 BE-eVLPs היו יעילות עריכה בסיסית גבוהה יותר באופן מובהק והם היו חזקים יותר מ-v4 BE-eVLPs. מעניין לציין שיעילות העריכה המקסימלית שהושגה עם v4 BE-eVLPs הושגה עם מינון נמוך פי 16 של v5 BE-eVLPs.
מסקנות
החוקרים של המחקר הנוכחי פיתחו מערכת אבולוציה מכוונת עבור eVLPs עם תכונות רצויות והשתמשו במערכת זו כדי לבצע מוטציות/בחירת מוטציות קפסיד eVLP עם תכונות משופרות. יתרה מכך, פותחו מכשירי v5 eVLP עם אריזת מטען משופרת ושחרור, גדלים גדולים יותר של חלקיקים ועוצמת אספקה גבוהה יותר מ-v4 eVLPs. בסך הכל, שיטת התפתחות eVLP מקודדת זו יכולה לתמוך בפיתוח של כלי אספקה עתידיים שמתגברים על המגבלות הקשורות למערכות עריכת גנים נוכחיות.
