הפרעות מוחיות כמו פרקינסון (PD) או מחלת אלצהיימר (AD) מתחילות להתפתח בחולים הרבה יותר מוקדם מאשר הופעת התסמינים הקליניים הראשונים שלהם. טיפול בחולים בשלבים מוקדמים אלו עשוי להאט או אפילו לעצור את מחלתם, אך אין כיום דרך לאבחן הפרעות מוחיות בשלבים הפרה-סימפטומטיים הללו. עד כה, ניתן לזהות את הנגעים המוחיים הספציפיים הנגרמים על ידי PD, למשל, רק על ידי ניתוח ביופסיות מוחיות, שניתן להשיג רק לאחר המוות.
כדי להתגבר על צוואר הבקבוק הקריטי הזה, חוקרים רודפים אחר המושג החדש של "ביופסיות נוזליות", הכולל מיצוי קל של דם או נוזלי גוף אחרים תוך שימוש בהליכים לא פולשניים, וניתוחם עבור מולקולות שמקורן במוח ורקמות מוצקות אחרות. מטרה מבטיחה במיוחד בנוזלי גוף הם "שלפוחיות חוץ-תאיות" (EVs), שקיות זעירות הקשורות לקרום המשוחררים על ידי המוח ותאים אחרים לנוזלים שמסביבם. שקים אלו מכילים מגוון של מולקולות שיכולות להיות ייחודיות לסוגי התאים המייצרים אותם, כמו המוח, וכך גם יכולים לשאת סמנים ביולוגיים מוגנים להתפרצות מוקדמת של פרקינסון ומחלות מוח אחרות.
עם זאת, למרות ההתקדמות האחרונה, מומחי EV לא הצליחו להתמודד עם הבעיה האם מולקולות ביולוגיות מסוימות שהם מדדו ב-EV מבודדים כלולות בקפדנות בתוך EV או קשורות באופן לא ספציפי לפני השטח שלהן. האתגר הזה למעשה מנע מהם את היכולת להסיק מסקנות חד משמעיות לגבי מולקולות מטען ברכבי חשמל מכל סוגי הרקמות.
כעת, צוות שיתופי בראשות דיוויד וולט, Ph.D. במכון Wyss באוניברסיטת הרווארד ובבית החולים Brigham and Women's (BWH) בבוסטון פתרו בעיה זו על ידי הוספת שלב מכריע לפרוטוקול אולטרה רגיש שכבר מאומת. על ידי עיכול אנזימטי של כל החלבונים הקשורים פני השטח מאוכלוסיית EV מטוהרת, הם הצליחו להתמקם באופן ספציפי על מטען מוגן בתוך EVs תוך ביטול "זיהומים" לא ספציפיים. באמצעות הפרוטוקול המשופר שלהם כדי למדוד את הסמן הביולוגי של PD ⍺-synuclein בדם, בפעם הראשונה הם הצליחו לקבוע במדויק את החלק הקטן של כל חלבון הכלול בתוך EVs לעומת כמה ממנו קיים חופשי בכל פלזמת הדם.
חשוב לציין, הם שילבו את ההתקדמות הזו עם מבחן זיהוי רגיש במיוחד שפותח עבור צורה של ⍺-סינוקלאין שהופך יותר ויותר מזורחן במהלך התקדמות PD והמצב הקשור לדמנציה של Lewy Body. בניתוח קבוצה של דגימות מטופלים, הם יכלו לזהות העשרה של חלבון ⍺-synuclein הפתולוגי בתוך EVs ביחס לסך הפלזמה. הממצאים מתפרסמים ב PNAS.
"מחקר על רכבים חשמליים בקבוצות שלנו ושל קבוצות אחרות בעשורים האחרונים קידמו בהתמדה את ההבנה שלנו לגבי הביולוגיה וההרכב המולקולרי המורכב שלהם. עם זאת, הבידוד של רכבי חשמל טהורים ספציפיים לרקמות מנוזלי גוף כמו דם או נוזל המוח השדרתי המקיף את העצבים המרכזיים מערכת, כולל המוח, ואימות וכימות התוכן האמיתי שלהן באמצעות מדידות מדויקות עדיין מציבים אתגרים טכניים אדירים", אמר וולט, חבר סגל ליבה של Wyss.
העבודה האחרונה שלנו מספקת פתרון שיעזור למלא את הפער הטכנולוגי הזה, ומקרבת אותנו ליכולת להשיג רכבים חשמליים נקיים מזיהום כדי להשתמש בהם כמקורות עשירים לסמנים ביולוגיים קליניים, כפי שאנו מראים בדוגמה של ⍺-סינוקלאין פוספוריל. ."
דיוויד וולט, מכון ויס באוניברסיטת הרווארד
וולט הוא ראש הפקולטה של מאיץ האבחון של מכון וייס, הוא גם פרופסור הנסיורג וייס להנדסה בהשראה ביולוגית בבית הספר לרפואה של הרווארד (HMS), פרופסור לפתולוגיה בבית החולים בריגהם ולנשים ופרופסור במכון הרפואי הווארד יוז.
מדם ל-EVs ועד סמנים ביולוגיים ועד לאבחון
מונעת במיוחד על ידי ההבטחה האבחונית של EV לאבחון מוקדם של PD, AD והפרעות מוח אחרות, קבוצת וולט מילאה באופן שיטתי חלקים חיוניים בפאזל טכני זה. עם תמיכה פילנתרופית מ-Good Ventures, יוזמת צ'אן צוקרברג ולאחרונה קרן מייקל ג'יי פוקס, הם פיתחו בעבר מסגרת טכנית לכימות רכבים חשמליים והשתמשו בכימות זה כדי להשוות בין שיטות בידוד רכבים מנוזלי גוף. המתודולוגיה שלהם משלבת טכניקת הפרדה המכונה כרומטוגרפיה של אי-הגודל (SEC) כדי לשחזר את רוב ה-EV מנוזלים ביולוגיים עם "מבחני Simoa" רגישים במיוחד שאפשרו להם לספור מולקולות חלבון בודדות הקשורות ל-EVs שהם לכדו והדמיינו עם נוגדנים ספציפיים. בשלב זה, הצוות הנדס מבחני Simoa עבור מגוון סמנים ביולוגיים ספציפיים ל-EV, וחשוב מכך, לא כלל חלבון שטח מועמד בשימוש נרחב, L1CAM, כמטרה לבידוד EVs ספציפיים למוח, מה שסיפק לתחום תיקון מהלך חשוב .
"כדי לענות על השאלה הפשוטה מבחינה רעיונית אך המאתגרת מבחינה טכנית של איזה אחוז של חלבון נתון (כגון ⍺-סינוקלאין) הקיים בפלזמה נמצא בתוך EVs ביחס לחוץ, השתמשנו בשיטות בידוד SEC שפיתחנו בעבר כדי לבודד את רוב EVs מפלסמה יחד עם 'מבחן הגנה על פרוטאינז' אופטימלי שבו אנו משתמשים באנזים כדי ללעוס בעדינות אך ביעילות את כל החלבונים מעל פני השטח של רכבי EV מבודדים, תוך השארת פנים ה-EV סגור הממברנה שלם". אמרה הסופרת הראשונה דימה טר-אונסיאן, Ph.D., שהיא מדען בכירה במכון וייס ועומדת בראש פרויקט EV יחד עם הסופר הראשון והעמית לפוסט-דוקטורט טל גלבוע, Ph.D.
כמו כן, כדי למדוד ⍺-סינוקלאין ברמות נמוכות מאוד, גלבוע, יחד עם פוסט-דוקטורט ג'ינה וואנג, Ph.D. ועוזרת המחקר של Wyss Sara Whiteman במעבדת Walt, פיתחו מבחן Simoa עבור ⍺-synuclein שהוא הרבה יותר רגיש מכל מבחן שדווח בעבר. באמצעות ניסוי זה בפרוטוקול שלהם, הצוות הצליח לקבוע שרוב ה-⍺-synuclein ב-EVs שבודדו באמצעות פרוטוקול SEC שלהם היו מוגנים וכי כמות זו מציגה פחות מ-5% מסך ⍺-synuclein בדם. הבנת כמות זו חשובה במיוחד למטרה הסופית של מדידת ⍺-סינוקלאין ב-EVs שמקורו בנוירון, שכן EVs שמקורם ברקמה ספציפית כמו המוח צפויים להיות נדירים יחסית ל-EVs מתאי דם, שבהם ⍺-synuclein גם מתבטא. .
חשוב לציין, בנוסף למבחן Simoa הרגיש במיוחד שאיפשר להם לזהות את החלבון ⍺-synuclein הרגיל ללא שינוי, הם גם פיתחו בדיקה שמסוגלת לזהות ⍺-synuclein שהופך לפוספורילציה באתר ספציפי (pSer129) במהלך הקורס. של התקדמות PD. "כאשר יישמנו את המתודולוגיה המתקדמת שלנו על עוקבה של דגימות דם שהתקבלו מחולים עם דמנציה PD ו-Lewy Body, כמו גם תורמי ביקורת בריאים, מצאנו שהיחס של ⍺-סינוקלאין מזורחן ביחס לסינוקלאין ⍺ הכולל היה שניים לשלושה- קיפול גבוה יותר בתוך מכוניות חשמליות ביחס לחלק החיצוני של מכוניות חשמליות", אמר גלבוע. "זה היה מרגש ביותר כי זה מצביע על כך ש-EV עשויות להגן על מצב הזרחון של חלבונים מפני פוספטאזות במחזור שאחרת היו מוחקים את הסימן המאוד אינפורמטיבי הזה." הצוות בוחן כעת האם ניתן להשתמש במבחנים אלה כדי להבדיל בין חולי PD מאנשים ללא המחלה.
"העבודה של הצוות של דיוויד וולט מציגה סיור-דה-force טכנולוגי שמקרב אותנו יותר ויותר לפלטפורמת אבחון של הדור הבא עם פוטנציאל יוצא דופן. בשלב זה, אנחנו לא רחוקים מלהשתמש באלו העשירים והאומרניים שמקורם בתאים. שלפוחיות כחלון להגיע לשיא למוחם של חולים מבלי להידרש לניתוח", אמר מנהל מייסד וויס דונלד אינגבר, MD, Ph.D., שהוא גם יהודה פולקמן פרופסור לביולוגיה של כלי דם בבית החולים לילדים של HMS ובבוסטון הפרופסור להנדסה בהשראה ביולוגית הנסורג וייס בבית הספר להנדסה ולמדעים יישומיים של ג'ון א. פולסון בהרווארד.
