צוות ב-NDORMS, אוניברסיטת אוקספורד פיתח גישה חדשה לשיפור משמעותי של הדיוק של רצף RNA. הם מצביעים על המקור העיקרי לכימות לא מדויק ברצף RNA קצר וארוך, והציגו את המושג של תיקון שגיאות "הצבעות הרוב" המוביל לשיפור ניכר בספירת מולקולרית RNA.
קרדיט תמונה: NDORMS, אוניברסיטת אוקספורד
רצף מדויק של חומר גנטי הוא חיוני בביולוגיה מודרנית, במיוחד להבנה וטיפול במחלות הקשורות לחריגות גנטיות. עם זאת, המתודולוגיות הנוכחיות נתקלות באילוצים מהותיים. במחקר ציון דרך, קונסורציום בינלאומי של חוקרים, בראשות אדם קריבס, פרופ' עמית בביולוגיה חישובית, וג'יאנפנג סאן, עמית מחקר פוסט-דוקטורט במכון בוטנר, אוניברסיטת אוקספורד, פיתחו שיטה חדשנית לתיקון שגיאות בהגברת PCR – טכניקה בשימוש נרחב המשמשת ברצף תפוקה גבוהה. על ידי איתור חפצי PCR כמקור העיקרי לכימות לא מדויק, המחקר, שפורסם ב-Nature Methods, נותן מענה לאתגר רב שנים ביצירת ספירות מוחלטות מדויקות של מולקולות RNA, שהוא חיוני ליישומים שונים במחקר גנומי.
החוקרים התמקדו במזהים מולקולריים ייחודיים (UMI), שהם רצפי אוליגונוקלאוטידים אקראיים המשמשים להסרת הטיות שהוכנסו במהלך הגברה של PCR. בעוד UMIs אומצו באופן נרחב בשיטות רצף, המחקר מגלה ששגיאות PCR יכולות לערער את הדיוק של כימות מולקולרי, במיוחד על פני פלטפורמות רצף שונות.
הגברה של PCR, חיונית עבור רוב טכניקות רצף ה-RNA, עלולה להציג שגיאות, ולפגוע בשלמות הנתונים. התמודדנו עם זה על ידי סינתזה של ברקודים UMI באמצעות בלוקים של נוקלאוטידים הומטרימר, שיפור תיקון השגיאות ואפשר כימות מולקולת RNA כמעט מוחלטת, שיפור ניכר בדיוק הספירה המולקולרית."
Jianfeng Sun, עמית מחקר פוסט-דוקטורט, מכון בוטנר
הומוטרימרים הם רצפי נוקלאוטידים המורכבים משלושה בסיסים זהים, למשל AAA, CCC, GGG. על ידי הערכת דמיון נוקלאוטידים של הומוטרימרים, שגיאות מתגלות ומתוקנות באמצעות שיטת "הצבעת רוב".
המחקר מדגים כי UMIs homotrimer מתעלים באופן משמעותי על UMIs מונומרים מסורתיים בהפחתת העשרה של קיפול חיובי כוזב במהלך ניתוח של גנים ותמלילים בעלי ביטוי דיפרנציאלי (DEGs ו-DETs). שיפור זה חיוני לזיהוי וכימות מדויקים של DEGs או DETs, במיוחד בגישות רצף בכמות גדולה. בנוסף, בריצוף של תאים בודדים, כאשר לעתים קרובות נדרשת הגברה נרחבת של PCR, UMIs הומטרימרים הוכחו כיעילים בהפחתת ההשפעות של חפצי PCR, ובכך משפרים באופן משמעותי את האמינות של נתוני ריצוף.
"על ידי בניית UMIs מגושים הומוגניים של נוקלאוזידים, שאפנו לשפר את תיקון השגיאות ברצף לקריאה קצרה וארוכה, תוך הצגת המחויבות שלנו לשיפור יישומי טכנולוגיית רצף", אומר פרופסור-משנה אדם קריבס, מחבר בכיר של המאמר ומנהיג קבוצה בביולוגיה חישובית.
למחקר הזה יש השלכות עמוקות. על ידי תיקון שגיאות PCR ב-UMIs, זה מגביר מאוד את דיוק הכימות המולקולרי ביישומי רצף שונים. זהו כלי חיוני לחוקרים בתחום RNA בתפזורת, RNA חד-תא ורצף DNA, המאפשר ביטוי גנים מדויק וניתוח פרופיל מולקולרי. תיקון שגיאות UMI משופר לא רק מפחית את השכיחות של תוצאות חיוביות שגויות, אלא גם מציע יישומי אבחון מרובים, במיוחד בתרחישים המחייבים ניתוח אורך של דגימות.
