ריפוי גנטי מחזיק בהבטחה למנוע וריפוי מחלות על ידי מניפולציה של ביטוי גנים בתוך תאי המטופל. עם זאת, כדי להיות יעיל, הגן החדש חייב להפוך אותו לגרעין התא. חוסר היכולת לעשות זאת באופן עקבי ויעיל פגע בהתקדמות בטיפול.
חוקרי אוניברסיטת קליפורניה בסן דייגו, בראשות המחלקה לביוכימיה וביופיזיקה מולקולרית פרופסור ניל דווארג', חשפו שיטה חדשה שמגבירה מאוד את היעילות של מסירת גנים תוך מזעור תופעות הלוואי המזיקות לתא. העבודה שלהם מופיעה ב תקשורת טבע.
כדי שטיפול גנטי יהיה יעיל, הגן המוכנס חייב להיות מועבר לתאי המטרה, ובסופו של דבר לעבור מהציטופלזמה של התא לגרעין. בעוד שהעברת גנים לציטופלזמה ידועה וסטנדרטית, השגת גנים מהציטופלזמה לגרעין יכולה להיות די מאתגרת.
כדי לפצות על יעילות טרנסלוקציה גרעינית נמוכה (מוערכת בסביבות אחוז אחד), טיפולי גנים פוטנציאליים יכולים לדרוש מינונים גבוהים מאוד של DNA כדי להבטיח שכמות נאותה תגיע לגרעין. מינונים גבוהים אלו יכולים לעורר תגובות חיסוניות וציטוטוקסיות.
מסירה של DNA לגרעין יכולה להיעשות באמצעות אותות לוקליזציה גרעינית (NLS) – רצפי פפטידים קצרים הפועלים כקודי דואר מולקולריים על ידי תיוג חלבונים מסוימים להובלה לגרעין. חיבור ה-DNA ל-NLS מאפשר לו להיכנס לגרעין. למרות ששיטה זו הייתה בפיתוח במשך כמה עשורים, התוצאות עד כה היו לא עקביות וקשה לשחזר.
מתודולוגיה זו התמודדה עם מספר אתגרים, הגדול שבהם היה שעד כה הכימיה לא הייתה מפותחת מספיק כדי לאפשר למדענים באמת לצפות ולהבין מה קורה במהלך אספקת הגרעין DNA-NLS. האם אורך ה-NLS משנה? האם הרווח בין ה-NLS ל-DNA משנה? האם חוקרים משתמשים ברצף NLS שגוי? האם עליהם לצרף מספר NLS ל-DNA?
מה שהיה צריך היה דרך לסנן את כל המשתנים האלה כדי שהחוקרים יוכלו לזהות בקלות אילו תמורות היו התוצאות הטובות ביותר. זה בדיוק מה שמעבדת Devaraj יצרה כאשר פיתחו זרימת עבודה בכימיה שיכולה לסנן בקלות צימודים של DNA-NLS, מה שמאפשר למשתמשים להגדיר את הפרמטרים של הצמידות.
ביצירת זרימת עבודה זו, הצלחנו לבצע מסכים חזקים, ובעצם להגדיר את כללי התכנון המאפשרים לך לחבר אחד מפפטידי NLS אלה לקלטת גן DNA. ראינו עלייה של יותר מפי עשרה באספקת DNA גרעיני".
זולפיקאר מוחמדשה, סטודנט לתואר שני בביוכימיה ומחבר ראשון של המאמר
איך זה נעשה
זרימת העבודה החדשה הותאמה מטכנולוגיית תיוג DNA אנזימטית, DNA-TAG, שפותחה בעבר במעבדת Devaraj. בעבודה זו, הצוות השתמש באנזים שמקורו בחיידקים TGT (tRNA guanine transglycosylase) כדי לשנות את ה-DNA עם ידית כימית המאפשרת הצמדות קלה של פפטידים ל-DNA, כולל פפטידי NLS.
בעזרת זרימת עבודה זו, המעבדה הצליחה לשנות קלטות גנים של DNA – קטעי DNA ניידים – עם פפטידים של NLS ולאחר מכן לשנות את הפרמטרים של ה-NLS: סוג ה-NLS בשימוש, הרווח בין ה-NLS ל-DNA, ומספר ה-NLS המחוברים ל-DNA. קלטת הגנים קודדה עם כתב eGFP שמאיר בירוק בתאים אנושיים עם מסירה וביטוי גרעיניים.
בדרך זו, הם הצליחו לסנן תמורות שונות של צימודים של DNA-NLS כדי לראות אילו שילובים היו היעילים ביותר בחדירה לגרעין. זרימת העבודה החדשה של ההקרנה מאפשרת לחוקרים להגדיר ולפרוס במדויק את מצומדי ה-DNA-NLS עם האספקה הגרעינית הגבוהה ביותר.
"הצלחנו לקבל ביטוי מה-DNA המכוון לגרעין גדול יותר מהביטוי של DNA ללא שינוי בכמות גדולה פי עשרה", קבע דבראג', אחד מחברי המאמר ויו"ר המחלקה לביוכימיה. "מה זה אומר שאתה יכול להעביר פחות DNA לתא תוך הגברת הביטוי, מה שאמור להפחית בעיות ציטוטוקסיות."
המטרה הסופית של כל טיפול גנטי היא לרפא חולים חולים, אז כדי לבדוק את זרימת העבודה שלהם, הצוות העביר קלטת גנים המקודדת לפקטור IX, חלבון החסר במחלת חג המולד, הפרעת דימום תורשתית נדירה. התוצאות שלהם הראו ביטוי גבוה פי 10 של פקטור IX בהשוואה לביקורות, והדגישו את הפוטנציאל של מצומדי DNA-NLS עבור יישומים של טיפול גנטי לא ויראלי.
המאמר הוא גם אחד הראשונים שהראו שרצפי DNA-NLS ספציפיים מתפקדים טוב יותר בסוגי רקמות ספציפיים: לרקמות הכבד היו פפטידים NLS ספציפיים שהיו טובים יותר לטרנסלוקציה גרעינית מאשר אם נעשה בהם שימוש ברקמות לב או כליות. מחקר נוסף יכול לגלות כיצד בדיוק ניתן לפרוס את מצמידות ה-DNA-NLS הללו למסירה ספציפית לרקמות.
הצוות היה רוצה להמשיך ולחקור האם מתן מצומדי DNA-NLS לתא מפחית את התגובה החיסונית – מכשול נוסף עם סוג זה של טיפול גנטי. הם גם חוקרים את השימוש בזרימת העבודה על הגברת עריכות ה-DNA הגנומיות באמצעות CRISPR-Cas-9, ומקווים להמשיך לשכלל את זרימת העבודה למשהו בר-תרגום קליני וניתן להרחבה יותר, ולקרב אותו ליד מיטת המטופל.
רשימה מלאה של המחברים: Zulfiqar Y. Mohamedshah, Chih-Chin Chi, Ember M. Tota, Alexis C. Komor and Neal K. Devaraj (כולם UC San Diego).
מימון מסופק, בחלקו, מ-Seawolf Therapeutics, The Camille & Henry Dreyfus Foundation (ST-25-025) והמכונים הלאומיים לבריאות (R35GM141939 ו-T32GM146648).
