מחקר זה מובל על ידי פרופסור Jue Ruan (האקדמיה הסינית למדעי החקלאות, שנזן, סין). המחברים פיתחו שיטת זיהוי איזותרמית בסיר אחד המבוססת על הגברה של מעגל מתגלגל (RCA) לזיהוי מהיר וספציפי של מירנאים ושברי RNA קצרים. שיטה זו משלבת זיהוי מטרה, הגברה של מעגל מתגלגל ליניארי (RCA ליניארי), יצירת פריימר בשפופרת אחת, וזמן הזיהוי יכול להתקצר תוך שעה אחת. יתר על כן, ROA הוא רגיש ביותר, ומשיג מגבלת זיהוי (LOD) של 6pM. התוצאות נקראות בקלות ויזואלית ומאומתות כדי להיות מדויקות כמו RT-PCR.
העיקרון של ROA הוא כדלקמן. ראשית, בדיקה מעגלית עבור ה-miRNAs מיועדת להיבדק. במהלך הגילוי, הבדיקה המעגלי נקשרת באופן ספציפי ל-miRNAs היעד ב-57°C-60°C. בדרך כלל, הגברה של מעגל מתגלגל מתבצעת תחת הפעולה של Bst פולימראז. כאן גם יצרנו באופן מלאכותי תגובות U-nick על ידי הוספת פרופורציה מסוימת של dUTP ו-restriction endonuclease שמזהה U. במקרה זה, גדיל ה-DNA החדש שנוצר במערכת התגובה יופסק על ידי UDG, וימשיך להפעיל חדש הגברה של מעגל מתגלגל כפריימר חדש, שיקדם את המבחנים להשגת הגברה אקספוננציאלית תוך זמן קצר. לבסוף, אנו משתמשים ב-SYBR Gold כאינדיקטור על ידי זיהוי מהיר של האותות הפלורסנטים. ROA יכול להגביר תבניות מרמת פיקוגרם (pg) לרמת מיקרוגרם (מיקרוגרם) תוך שעה. ROA הראה יכולת הסתגלות מצוינת בעת בדיקת miRNA באורכים שונים מ-18 עד 24 nt. במבחן הספציפיות, נמצא ש-ROA רגיש לחוסר התאמה של נוקלאוטידים בודדים, במיוחד בקצה 3'. בהשוואה ל-RCA אחרים בסיוע UDG, ל-ROA יש ספציפיות טובה יותר.
אנו עוד חוקרים את יכולת הזיהוי של ROA עבור וירוסי RNA-;-; MS2 פאג. נמצא ש-ROA יכול לזהות ביעילות את RNA היעד של הפאג MS2 אפילו מבלי להסיר את המארח. זה מדגים את הפוטנציאל הברור של מבחן ROA זה לזיהוי נוח ומהיר של וירוסים.
