במחקר שפורסם לאחרונה בכתב העת תקשורת טבעחוקרים ניתחו בצורה מבנית בקרת נוקלאוטידים של אדנין ומחלות ניווניות במוח במחלפי ClC-3.
מחקר: בסיס מבני של ויסות נוקלאוטידים אדנין ופתולוגיה נוירודגנרטיבית במחליף ClC-3. קרדיט תמונה: Lightspring / Shutterstock
ClC-3, מחליף כלוריד/פרוטונים, הכרחי לניטור רמות האנרגיה המטבולית ומופעל על ידי אדנוזין טריפוספט (ATP). מוטציות מסוג נקודה בתעלות היונים ClC-3 יכולות לגרום להפרעות נוירולוגיות בבני אדם.
הגורם לשיפור התפקוד של המוטציות הללו נותר לא ברור. ClC-3, ClC-4 ו-ClC-5 הם חיישני אנרגיה מטבולית המסייעים בהחמצה ומסיטים זרם חשמלי מסוג ATPase (V-ATPase) מסוג ואקוולרי. לחיות נוקאאוט יש ניוון חמור ברשתית ופירוק חלבון חריג.
שתי גרסאות ClC-3 הגורמות למחלה בבני אדם, T570I ו-I607T מייצרות אמפליטודות זרם גבוהות יותר במתחים טרנסממברניים טעונים שלילי, אם כי המנגנון אינו ידוע.
לגבי המחקר
במחקר הנוכחי, החוקרים השיגו מבני ClC-3 של עכברים דימריים ברזולוציה גבוהה במצבי אפו ושילבו אותם עם אדנוזין מונופוספט (AMP), אדנוזין דיפוספט (ADP) ו-ATP. הם גם חקרו את המוטציה של I607T בצורות הקשורות לאפו ו-ATP.
החוקרים השתמשו במיקרוסקופיה אלקטרונית קריוגנית כדי לזהות מבני ClC-3 בנסיבות שונות, תוך אימות המשמעות התפקודית של שאריות ריפוד המסלול באמצעות מוטגנזה מכוונת-אתר ורישום טלאים. כדי להקל על לוקליזציה של קרום הפלזמה של ClC-3, הם הכניסו מוטציות נקודתיות בקצה N ושינו את E282 ל-Ala. הם השתמשו בביוטינילציה של פני השטח והדמיה קונפוקלית כדי לחקור את הביטוי של מוטציות ClC-3 על משטחי תאים.
חוקרים העריכו את ההשפעה של ATP על ClC-3 באמצעות פרמטר יחס הנוכחי, שהושג על ידי השוואת משרעת הזרם הגבוהה ביותר שהושגה לאחר התגברות ATP למשרעת ההתחלה לפני התגברות ATP. הם שיערו ש-ATP הוא גורם פוטנציאלי של מחליף זה.
הם בחנו את מבנה ClC-3 ברזולוציה של 3.3 Å כדי להבין את תהליכי הקישור ל-ATP ואת הפוטנציאל שלהם. תוך התבוננות בצפיפות נוספת הדומה ל-ATP בין שני תחומי ה-CBS התוך-תאיים, הם הזריקו ATP לדגימות חלבון ClC-3 לפני ההקפאה כדי להפחית הידרוליזה.
חוקרים ביצעו סימולציות דינמיות מולקולריות של כל האטומים (MD) של mClC-3ATP, mClC-3ADP ו-mClC-3AMP כדי להבהיר את תצורת הקישור של ATP במחלפי ClC-3. הם גם בחנו את המסלולים להובלת יונים בתוך התחומים הטרנסממברניים וביצעו ניתוח רשת דינמי.
הם הציגו מוטציות נקודתיות למסלול המידע ההדדי, תוך מדידת התגברות ATP במוטנטים אלה, והם גם פתרו את המבנה של המוטנט I607T במצבים הקשורים ל-apo ו-ATP.
תוצאות
בנוגע למבנה ClC-3, חוקרים גילו תעלות מוליכות כלוריד בתחומים הטרנס-ממברניים של כל תת-יחידת mClC-3apo באמצעות תוספים CAVER ב-PyMOL, המחברים לומן אנדוזומלי לציטוזולים. שאריות הקשורות לתעלות מוליכות יונים ClC, כמו E282-gating glutamate, נמצאים גם הם לאורך מסלול זה, כאשר שרשרת הצד מכוונת כלפי מעלה.
החוקרים גילו צפיפות אלקטרונים משולשת, ככל הנראה מעידה על שלושה Cl– יונים ממש מתחת ל-E282 (או Sext), קרוב ל-Y630 (או ל-Sin), ובין השניים (Scen), זהים לאלה שבמחלף ClC-7. מוטציות E282 לתוך Ala הפחיתו תיקונים כלפי חוץ והגדילו את משרעת הזרם במהלך היפרפולריזציה על ידי ניתוק הובלת פרוטונים וכלוריד.
מוטציה של S453 באזור Sext ל-Arg הוכיחה כי המטענים החיוביים הנוספים שהוכנסו ככל הנראה קידמו העשרת יוני כלוריד בעלי מטען שלילי, והגדילו את הזרמים החיצוניים בפוטנציאלים של ממברנה מסוג חיובי.
החלפת חומצת אמינו Y630A הגדילה את הזרם עם דה-פולריזציה. החוקרים גילו נתיב יון מפוצל שמתחיל קרוב לאזור Scen ועובר מאחורי Helix P ו- Helix O. E339, גלוטמט פרוטוני שמור הקיים במחליפי ClC, נמצא בכניסה הציטוזולית של נתיב זה. שינוי שאריות אלה הגדיל את זרמי ClC-3.
החלבון mClC-3 נשאר יציב לאורך הסימולציה של 300 ns, כאשר סטייה מרובעת ממוצעת (RMSD) הגיעה לרמה של 30 ns. לשם השוואה, AMP או ADP כמעט ולא הגדילו את הזרם. הוספת ריכוז רוויה של ADP או AMP (500 µM) הביאה לצפיפות אלקטרונים במבנים mClC-3ADP ו-mClC-3AMP.
כיס הקישור ל-ATP של ClC-3 הראה צורה ורצף דומים ל-ClC-5 ו-ClC-7, כאשר קישור ATP מיוצב על ידי שיירים מ-N terminus, CBS1 domain ו-CBS2 domain. מוטציות בשאריות אלו הביאו לפוטנציאלציה של ATP הרבה פחות.
אינטראקציה של ATP גרמה לשינויים קונפורמציוניים בשאריות הראשוניות בתחומים הטרנסממברניים, והגבירה את הובלת יוני Cl. עם זאת, שינויים בהולכה, הסתברויות פתוחות וביטויי ClC-3 עשויים לגרום לשינויים בהובלת יוני Cl במוטנטים. הוספת 10.0 mM ATP לתיקון נוזלי פיפטה בתצורות מדבקות של תא שלם שיפרה את יכולתו של המחליף לשלוט ב-ClC-3 באמצעות נוקלאוטידים של אדנין.
מסקנות
המחקר זיהה את הבסיס המבני לאינטראקציות ClC-3 עם נוקלאוטידים אדנין, הבהיר את תפקידו כחיישן אנרגיה מטבולית ומקשר בין רמות האנרגיה התאית לפעילות האנדוזומלית. חוקרים מצאו מסלולי הובלה של יוני Cl ו-H+ דומים לאלו שנצפו בחלבוני ClC אחרים ובצפיפות אלקטרונים המתקרבים ל-Cl-ions ולמולקולות מים.
המוטציה של S453R ב-ClC-3 הייתה קשורה להפרעות נוירו-התפתחותיות. נוקלאוטידים של אדנין מווסתים את ClC-3 בצורה שונה, כאשר ATP נקשר ל-ClC-3 בזיקה גדולה יותר. המוטציה של I607T מתייחסת ל- myotonia congenita ולניוון עצבי מוקדם.
