הפיתוח של תרופות טיפוליות חדשות המתמקדות בחלבון קינאזות הוא חיוני במאבק במחלות כמו סרטן. תכניות גילוי תרופות קינאז מסתמכות על אפיון וסריקה מדויקים של מעכבי קינאז חזקים. פלטפורמת בדיקות מוכחת קלינית ומאומתת חיונית לשילוב בצינורות הגילוי והפיתוח הפעילים הללו.
שיטות מסורתיות למדידת פעילות קינאז, כגון אלו המשתמשות ברדיואיזוטופים או מחקרי קישור פשוטים, יכולות להיות מאתגרות, לא בטוחות, ולעתים קרובות אינן מצליחות לתאם את נתוני הקישור עם פעילות אנזימטית פונקציונלית. יתר על כן, בשל נוכחותם של אתרים פעילים שמורים והומולוגיה מבנית גבוהה בין קינאזות, פיתוח מעכבי קינאז סלקטיביים הוא תהליך מורכב הדורש אימות בכל שלב.
ערכות פעילות HitHunter Kinase: פתרון אמין
ה-Eurofins DiscoverX HitHunter® ערכות בדיקת פעילות Kinase מפותחות באמצעות ה-ADP Hunter Plus המבוסס היטב™ טכנולוגיה למדידת פעילות קינאז. ערכות אלו עברו בדיקות פעילות מקיפות, כולל אופטימיזציות לריכוזי ATP וקינאז, מה שמאשר את התאמתן בפיתוח מבחן. הם חדשניים, מוכנים לשימוש ומאומתים לבדיקת מעכבי קינאז בעלי מאפיינים מרכזיים.
- מוכן לשימוש ונוח: ערכות מגיעות עם כל הריאגנטים הדרושים (כולל קינאז המטרה) ומותאמות בקפדנות לביצוע פעילות סינון קינאז
- תאימות עם תפוקה גבוהה: מתאים גם לפורמטים בקנה מידה קטן (96-באר) וגם בפורמטים של הקרנה בתפוקה גבוהה (HTS)
- לא רדיואקטיבי וללא נוגדנים: פורמט הבדיקה הפשוט, ההומוגני (ללא כביסה) קל להפעלה, אינו דורש נוגדנים ובטוח יותר משיטות רדיואקטיביות מסורתיות
כיצד פועל מבחן ה-ADP Hunter?
הערכות משתמשות בטכנולוגיית ADP Hunter Plus למדידה ישירה של פעילות קינאז (איור 1). טכנולוגיה זו מתמקדת בתוצר הלוואי האוניברסלי של פעילות קינאז, ADP.
- ריאגנטים לזיהוי ADP Hunter Plus משתמשים במערכת אנזים מצמודה ליצירת מי חמצן (H₂O₂) מה-ADP המיוצר (אופייני לתגובת קינאז שבה האנזים מעביר פוספט מ-ATP למצע, ומייצר ADP).
- לאחר מכן, ה-H₂O₂ מגיב עם מבשר צבע ניאון (ADHP) בנוכחות פרוקסידאז כדי ליצור צבע ניאון גבוה הנקרא resorufin.
- צבע ה-resorufin מספק קרינה יציבה ובהירה המוזזת באדום (~590 ננומטר), ובכך מפחיתה הפרעות מ-autofluorescence ביולוגית ומשפרת את יחס האות לרעש ואת הרגישות למבחן.
- פורמט בדיקת רווח-של-אות נוח זה מספק תוצאות תוך כ-90 דקות באמצעות קריאה פלואומטרית.
אימות לבדיקת מעכבי קינאז (דוגמה לAMPK)
Eurofins DiscoverX פרסמה 50 מבחני (נכון לנובמבר 2025) וממשיכה להרחיב את הפורטפוליו שלה. כל בדיקה עברה אופטימיזציה קפדנית כדי לאפשר לחוקרים לחסוך זמן ולסנן קינאזות בביטחון.
כדוגמה, אופטימיזציה ואימות של מבחנים לבדיקת מעכבי קינאז בוצעו עבור קומפלקס AMPKα1β1γ1 קינאז באמצעות טכנולוגיית ADP Hunter.
שלבי מפתח בתהליך הפיתוח של הבדיקות כוללים:
- קביעת התאמת הבדיקה: טיטרציה של אנזים אישרה אות חזק בריכוז קינאז נמוך (1 ננוגרם/באר).
- אופטימיזציה של ריכוזי ATP ומצע: הריכוזים של ATP והמצע נקבעו על סמך ערכי ה-Km המחושבים שלהם כדי להבטיח שהם אינם מגבילים קצב. לדוגמה, ריכוז ה-ATP הסופי של המבחן נקבע ל-3 x Km ATP (87 מיקרומטר) – שלב קריטי לבדיקת מעכבי ATP תחרותיים.
- בדיקת מעכבים: המבחן אושר כמתאים לבדיקת מעכבים על ידי בדיקת מעכב הייחוס, staurosporine (מעכב תחרותי ATP), וגם המעכב הספציפי, BAY-3827 (איור 2).
התייחסות ובדיקת מעכבים ספציפיים
כדי לאשר את ההתאמה לבדיקת מעכבים, המבחן מדד פעילות קינאז ב-1 ng/well (50 ng/mL) kinase מול טווח של ריכוזי מעכבי ייחוס. לאחר הוכחת התאמה (איור 2. א'), המעכב הספציפי AMPK BAY-3827 נבדק במבחן כדי לספק נתוני אימות נוספים. פעילות קינאז נמדדה בטווח של ריכוזי מעכבים ספציפיים, כפי שמוצג באיור 2. ב.
מַסְקָנָה
ערכות פעילות אנזים קינאז של HitHunter נבדקות בקפדנות עם מגוון קינאזות ומצעים ומשמשות כבחירה זמינה לשימוש עבור סקר מעכבי קינאז והאצת גילוי תרופות מעכבי קינאז חדשות. המבחנים מאפשרים הבנה טובה יותר של קשרי מבנה/פעילות (SAR), נמנעים מחובות רעילים, ובכך תומכים בבחירת מועמדים מעולים לתרופות.
