במחקר שפורסם לאחרונה בכתב העת מיקרוביולוגיה של הטבע, קבוצת חוקרים זיהתה ואפיינה את BilR, אנזים חדשני שמקורו במיקרוביוטה במעיים, וחקרה את תפקידו בהפחתת הבילירובין לאורובילינוגן, החיוני לשמירה על הומאוסטזיס בילירובין בבני אדם.
רקע כללי
בילירובין, תוצר לוואי מרכזי של פירוק הדם, הוא חיוני בפיזיולוגיה של האדם, במיוחד בציר המעי-כבד. מופרש לתוך המעי, הוא מופרש או נספג מחדש לאחר ביטול צימוד על ידי בטא-גלוקורונידאז.
מיקרואורגניזמים במעיים מעבירים אותו עוד יותר ל-urobilinogen ו-stercobilinogen הניתנים להפרשה, ומשפיעים על רמות הבילירובין בסרום ועל הבריאות. רמות בילירובין מתונות פועלות כנוגדי חמצון, אך רמות גבוהות עלולות לגרום לצהבת או לקרניקטרוס.
חיידקי מעיים מפחיתים באופן ייחודי את הבילירובין לאורובילינוגן, תהליך חיוני בהומאוסטזיס של בילירובין. דרוש מחקר נוסף כדי להבין היטב את המנגנונים שבהם BilR ואנזימים מיקרוביאליים אחרים במעיים משפיעים על חילוף החומרים של בילירובין והשלכותיהם הרחבות יותר על בריאות האדם, במיוחד בהקשרי מחלה.
לגבי המחקר
השיטות ששימשו במחקר זה כללו שילוב של סקר ניסיוני, גנומיקה השוואתית ומבחני פלואורסצנציה לזיהוי האנזים בילירובין רדוקטאז, BilR. הצוות שיער שהאנזים שאחראי להפחתת הבילירובין הוא אוקסדורדוקטאז הפועל על קשרים כפולים פחמן-פחמן.
הם חיפשו גנים המקודדים לאנזים זה במינים מיקרוביאליים במעיים, תוך התמקדות באלה הקיימים במינים המסוגלים להפחית בילירובין ונעדרים באלה שאינם. באמצעות מבחני פלואורסצנטי, החוקרים בדקו תמציות מחיידקים שונים שגדלו במדיה בתוספת בילירובין.
מבחני אלו התבססו על העיקרון שניתן לחמצן את התוצרים הפוטנציאליים הבלתי יציבים של אורובילינוגן, הפחתת בילירובין וסטרקובילינוגן לצורות יציבות יותר ולזהות באמצעות פלואורסצנטי, בעוד בילירובין שאינו קשור לחלבון אינו פלואורסצנטי.
החוקרים זיהו פעילות הפחתת בילירובין בתשעה זנים, כולל שלושה שלא ידועים קודם לכן ביכולת זו. כל המצמצמים השתייכו לכיתה קלוסטרידיה של הפילום Firmicutes. לאחר מכן נערך ניתוח גנומי השוואתי על חמישה זנים מפחיתי בילירובין וחמישה חומרים שאינם מפחיתים קרובים.
ניתוח זה חשף שתי קבוצות אורתו-קבוצות המתאימות לדפוסי הנוכחות וההיעדר התואמים לפנוטיפ הפחתת הבילירובין. אחד מאלה היה אנזים ללא הערות, הומולוגי ל-2,4-dienoyl-CoA רדוקטאז, קשרים כפולים של פחמן-פחמן מפחית אוקסדורדוקטאז, בדומה לתגובת הפחתת הבילירובין הצפויה.
לאחר מכן, הצוות ניתח אופרונים המכילים בילירובין רדוקטאזים המשוערים, וזיהה שלוש גרסאות של אופרון בילירובין רדוקטאז משוער. אופרונים אלו כללו שילובים שונים של שלושה גנים, bilQ, bilR ו-bilS. הגן bilR זוהה בתור הבילירובין רדוקטאז המשוער, bilS כחלבון דמוי פלבודוקסין, ו-bilQ כמווסת שעתוק. וריאציות באופרונים אלה נמצאו בין זנים שונים, כאשר לחלקם יש את כל שלושת הגנים ואחרים רק אחד או שניים.
כדי לאמת באופן ניסיוני את תפקידו של BilR בהפחתת בילירובין, הצוות ביטא גנים bilRS ו-bilR ב אי קולי (אי – קולי) והשתמשו במבחני פלואורסצנציה ובכרומטוגרפיה נוזלית וספקטרומטריית מסה טנדם (LC-MS/MS) כדי לאשר הפחתת בילירובין לאורובילינוגן. בדיקות אלו הראו קרינה משמעותית ונוכחות של אורובילין בדגימות שעברו טרנספורמציה עם גנים של BilRS, ובכך אישרו כי BilR מסוגל להפחית את הבילירובין לאורובילינוגן.
תוצאות המחקר
ניסויים ראשוניים במחקר התמקדו בזיהוי מינים של חיידקים בעלי יכולות הפחתת בילירובין. באמצעות בדיקת פלואורסצנציה על חיידקים שתורבתו במדיה עם תוספת בילירובין, החוקרים זיהו מינים שעלולים להפחית את הבילירובין.
Clostridioides difficile cluster of differentiation 3 (CD3), מפחית בילירובין ידוע, שימש כביקורת חיובית. בדיקה זו גילתה פעילות הפחתת בילירובין בתשעה זנים, כולל שלושה שלא הוכרו בעבר כמפחיתי בילירובין: Clostridium symbiosum, Clostridium sp. M62/1, ו Ruminococcus gnavus CC55_001C.
הניתוח הגנומי ההשוואתי נערך על חמישה זנים מפחיתי בילירובין וחמישה לא מפחיתים קרובים. מבין 6,256 אורתוקבוצות שזוהו, 389 חזו אוקסדורדוקטאזות, אך רק שתיים תאמו את דפוס הנוכחות או ההיעדרות הקשורים להפחתת בילירובין. אחד מהם היה הומולוגי ל-2,4-dienoyl-CoA רדוקטאז, אנזים המפחית קשרים כפולים פחמן-פחמן, המתאים לתגובת הפחתת הבילירובין הצפויה.
ניתוח של אופרונים המכילים בילירובין רדוקטאזים משוערים זיהה שלוש גרסאות של אופרון בילירובין רדוקטאז משוער, הכוללים את הגנים bilQ, bilR ו-bilS. BilR, שזוהה כ-billirubin reductase המשוער, שונה בהרכבו הגנטי בין המינים.
ב Ruminococcus gnavus ל-CC55_001C, ל-BilR היו שני תחומים C-טרמינליים נוספים, תחום דמוי פלבודוקסין, ותחום קושר Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate Hydrogen (NADPH). מבנה זה הציע תפקיד פוטנציאלי בהעברת אלקטרונים.
כדי לאמת את BilR כבילירובין רדוקטאז, הגנים מ Clostridium symbiosum, Clostridioides difficile, ו Ruminococcus gnavus באו לידי ביטוי בצורה הטרולוגית ב אי – קולי. בדיקת הקרינה וניתוח LC-MS/MS אישרו הפחתת בילירובין לאורובילינוגן, מה שמצביע על הספיקות של BilR בזירוז תגובה זו.
יתרה מכך, על ידי זיהוי שאריות מפתח, המחקר תיאר רצפי BilR מבני משפחת אנזים צהובים אחרים. קליד מסוים אחד, קליד 1, היה כנראה קליד בילירובין רדוקטאז. זה אושר על ידי ניסויים פונקציונליים על שאריות D166 ו-R167 שעברו מוטציה, חיוניים להפחתת בילירובין. החלבון שעבר מוטציה הראה פעילות נמוכה משמעותית, מה שמאשר את חשיבותם של שאריות אלו בתהליך ההפחתה.
המחקר גם חקר את ההתפלגות הטקסונומית של בילירובין רדוקטאזות, ומצא אותם בעיקר במינים של Firmicutes. הניתוח הצביע על כך שהפחתת בילירובין עשויה להיות ספציפית לזן במינים מסוימים, עם וריאנטים מובהקים של bilR מפוזרים באופן נרחב על פני מספר רב של פילות.
לבסוף, ניתוח של מטאנומים במעיים אנושיים גילה כי בילירובין רדוקטאז נעדר לעתים קרובות במעיים של תינוקות במהלך החודשים הראשונים לחיים, בהתאמה לתקופת הסיכון לצהבת יילודים. לעומת זאת, זה היה כמעט אוניברסלי בדגימות מבוגרים בריאים.
היעדר בילירובין רדוקטאז היה גבוה יותר באופן מובהק בחולים עם מחלת קרוהן או קוליטיס כיבית, וקושר שינויים טקסונומיים מיקרוביאליים במחלות דלקתיות לפגיעה בהפחתת בילירובין במיקרוביום של המעי.
